Thermo Fisher Scientific

Accelerating ScienceLearning at the Bench / 分子生物学実験関連 / 常に頭に入れておきたいDNAクローニングに関する7つのポイント

常に頭に入れておきたいDNAクローニングに関する7つのポイント

作成者 10.01.2015

実験がうまく行っている時ほど気にしていないのが、ルーチンワークの目的遺伝子のクローニング実験。ハマってしまう前にポイントを再確認しておきましょう！

今回は、実験をする際に常に頭に入れておきたい、クローニングに関する7つのポイントをご紹介します！みなさんも実験の際に参考にしてみてください。

インサートの性質

通常、PCRにより増幅した断片をリニアベクターに挿入し、クローニングを行なうのが迅速で効率的な方法です。もちろん、すべてのPCR断片が同一のベクターに同じ効率でクローン化されるわけではありません。このような差異は、断片のサイズ、インサートの毒性、およびインサートの複雑性により生じます。いずれのベクター（pCR®2.1、pcDNA™3.1、pUC18）においても、逆向き反復、ATリッチ、またはGCリッチ反復配列は、クローン産物としての断片を不安定にする原因となります。

インサートのサイズ

クローン化する断片のサイズは、クローニング効率の最も重要な因子です。大きなDNA断片（≥5 kb）を高コピーベクターでクローニングすることも可能ですが、その効率は非常に低くなります。

ベクターとインサートとの比

確実に効率の良いクローニングを行なうためにはインサートに対するベクターのモル濃度比を最適化することが重要です。クローニングを成功させるための比率は1:1 ～ 1:10の範囲であると考えられます。至適比を決定するために用いられる一般的な方法の一つは、1:1、1:3および1:5のように数種類のベクター：インサート比で調製を行なうことです。これらの比は、すべてのクローニングに適しているとは限りませんが、大部分のクーニングの必要条件に共通するものです。例えば、ベクターが3 kb、インサートが1 kbの場合、モル比を1:1にするためには3倍量のベクター（DNA量で）を添加する必要があります。

新鮮なPCR産物

TA、TOPO®TA、およびDirectional TOPO® Cloningにおいては、新鮮なPCR産物を使用することをお勧めします。これは、時間が経つにつれてヌクレオチドのオーバーハングが分解し、クローニングの効率を低下させるエキソヌクレアーゼが存在している可能性があるためです。推奨はされませんが、4℃で1週間保存後にPCR産物のクローン化に成功した例もあります。

ポジティブコントロールとネガティブコントロールの重要性

クローニング実験ではポジティブコントロールとネガティブコントロールの重要性を無視することはできません。クローニングとトランスフォーメーション反応に適切なポジティブ、ネガティブのコントロールがないと、クローニングの結果を評価することが非常に困難になります。これらのコントロールはコンピテントセルのDNA合成における酵素活性とトランスフォーメーション効率の指標なのです。コントロールが行なわれないと、トラブルシューティングは事実上不可能です。クローニング反応の効率を保証するため、弊社の各キットにはコントロールが含まれています。

ベクターとインサートのDNA末端の互換性

TAクローニングテクノロジーは、Taqポリメラーゼによって生成されたPCR産物をクローニングするようにデザインされています。これはPCR産物の各末端に単一の3′-Aオーバーハングを付加するこのポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性を利用しています。平滑末端クローニングベクターと方向性TOPO®クローニングテクノロジーは、Pfxなどのプルーフリーディングポリメラーゼによって生成されたPCR産物をクローニングするようにデザインされています。クローニングの成功はクローニングベクターに正しいポリメラーゼを使用するかどうかにかかっています。

PCR増幅後の3′-Aオーバーハングの付加

プルーフリーディングポリメラーゼによって増幅されたDNAをTA Cloning®ベクターやTOPO TA Cloning® ベクターに直接クローニングするのは、クローニング効率がきわめて低いためしばしば困難です。これはプルーフリーディングポリメラーゼがTA Cloning®やTOPO TA Cloning®に必要な3′-Aオーバーハングを除去する3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有しているためです。平滑末端フラグメントに3’アデニンを付加する簡単な方法を以下に示しました。これ以外の方法も利用できます。

材料

  • Taqポリメラーゼ
  • 100％エタノール
  • 72℃で安定させたヒートブロック
  • 80％エタノール
  • フェノール-クロロホルム
  • TEバッファー
  • 3 M酢酸ナトリウム

プロトコール

  1. プルーフリーディングポリメラーゼで増幅後、試料を氷上に置き、試験管あたり0.7 ～ 1ユニットのTaqポリメラーゼを添加します。よく攪拌します。反応バッファーの交換やプルーフリーディングポリメラーゼの除去は必要ありません。十分な数のPCR産物が3′-Aオーバーハングを保持しています。
  2. 72℃で8 ～ 10分間インキュベートします（サイクルしません）。
  3. 氷上に置き、直ちにTA Cloning® またはTOPO TA Cloning® 反応液に入れます。反応液を保存したい時はステップ4に進みます。
  4. 等量のフェノール-クロロホルムで反応液を抽出します。この操作ですべてのポリメラーゼが除去されます。
  5. 1/10量の3 M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加してDNAを沈殿させます。
  6. 室温で5分間、最高速度（卓上遠心機で14,000 rpm）で遠心分離を行なってDNAをペレットにします。
  7. エタノールを除去し、80％エタノールでペレットをリンスして風乾します。
  8. ペレットをTEバッファーに再懸濁させてPCR増幅反応液の開始量とします。これでPCR増幅産物はTA Cloning® ベクターやTOPO TA Cloning® ベクターにライゲーションできるようになりました。

まとめ

いかがでしたか？

つい忘れてしまうクローニングに関するポイントを、ぜひ頭の片隅に入れて実験してみてください！

これだけは知っておきたいクローニングの基礎知識、ココにあります！

Invitrogen 分子生物学教室では、分子生物学の教育のメインとして、初心者だけでなく経験のある分子生物学者のために、豊富で信頼できる技術的な内容をご提供しています。基礎知識を学ぶ時にはいつでも、Invitrogen 分子生物学教室の無料PDFを活用してください！

ダウンロードする

 

 

研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。

記事へのご意見・ご感想お待ちしています

  • サーモフィッシャーサイエンティフィックジャパングループ各社は取得した個人情報を弊社の個人情報保護方針に従い利用し、安全かつ適切に管理します。取得した個人情報は、グループ各社が実施するセミナーに関するご連絡、および製品／サービス情報等のご案内のために利用させていただき、その他の目的では利用しません。詳細は個人情報の取扱いについてをご確認ください。
  • 送信の際には、このページに記載のすべての注意事項に同意いただいたものとみなされます。