シーケンス反応には、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ダイターミネーター）を用いることで、伸長産物に蛍光が標識されます。シーケンス反応後の反応液中には、使われなかったダイターミネーターが存在します。残存のダイターミネーターが伸長産物とともにキャピラリーに取り込まれると、大きなピーク（Dye Blobピーク）として検出され、その部分のベースコールの精度を低下させます。このため、シーケンス反応後は、未反応のダイターミネーターを取り除く精製が必要となります。
一方で、「サンプル数が多い場合、精製工程は手間と感じる」、「目的領域とDye Blobピークが重ならなければ、精製は不要ですか？」とのお声をいただいたことがありました。そこで、シーケンス反応後、精製せずにそのままジェネティックアナライザでランすると、どのような結果になるか、検証してみました。
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実験
使用試薬
- pGEM -3Zf(+) double stranded DNA Control Template (※)
- -21 M13 Control Primer (※)
- Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
※BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitに含まれます。
使用機器
- サーマルサイクラー： Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR System
- シーケンサー： Applied Biosystems™ SeqStudio™ Genetic Analyzer
実験
表1、2の条件でシーケンス反応後、伸長産物を精製せずに電気泳動を行いました。電気泳動は、SeqStudio Genetic Analyzerを使用し、MediumSeqの条件で実施しました。
| 組成 | 量/反応 |
| BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix | 4 µL |
| x5 Sequencing Buffer | 2 µL |
| pGEM -3Zf(+) DNA Control Template（200 ng/µL） | 1 µL |
| -21 M13 Control Primer（0.8 pmol/µL） | 4 µL |
| 脱イオン水 | 9 µL |
| 全量 | 20 µL |
| ステップ | |||||
| ホールド | 25 サイクル | ホールド | |||
| 温度 | 96℃ | 96℃ | 50℃ | 60℃ | 4℃ |
| 時間 | 60秒 | 10秒 | 5秒 | 75秒 | ∞ |
結果
得られたRawデータを図1に示します。シーケンス産物のピークよりも大きなシグナル強度で、4つのピークがみられ（図1(a) 矢印）、ピーク位置は、～65、65～90、90～120、280～310 baseでした。これら4つのピークより低いシグナル強度の、ブロードなピークも複数観察されました（図1(b) 点線枠内）。これらはいずれも、未反応のダイターミネーターに由来すると考えられます。
図1 未精製シーケンス産物のRawデータ
(a) 縦軸最大値 32000 RFU、(b) 縦軸最大値 1200 RFU
Quality Value（QV）は、塩基当たりのベースコール精度の指標となる値で、図2では、エレクトロフェログラムの上にQVバーとして表示されています。QVバーが高いほどQVの値が高いことを示しており、図2では、バーが青色の塩基は、良好な精度でベースコールできていることを示します。シーケンス反応後、精製せずに泳動を行うと、前述の大きなピークの所に加え、複数のブロードピークの箇所で、広範囲にわたりベースコールの精度が悪化しました（図2 (a)）。比較データとして、表1、2の条件でシーケンス反応後、Applied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kitにより精製した場合のデータを図2 (b)に示します。エレクトロフェログラムの上には青色のQVバーが連続しており、良好な精度でベースコールされたことが確認できました。
図2 シーケンス産物のエレクトロフェログラム（0-390 bp）
(a) 未精製、(b) BigDye XTerminator精製
まとめ
今回は、SeqStudio Genetic Analyzerにて、シーケンス反応産物を精製せずに泳動し、シーケンス結果への影響を検証しました。得られたエレクトロフェログラムには、4つの大きなピークとともに、これらよりも低いシグナル強度のブロードなピークが複数みられ、広範囲にわたりベースコールの精度が悪化することが分かりました。今回の結果から、シーケンス反応後の精製工程を省略すると、目的領域の解析結果へ影響する恐れがあると考えられます。より良いシーケンス解析結果を得るためにも、シーケンス反応後は精製を行っていただくことをお勧めします。
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