ActivX™ Desthiobiotin-GTP-Sonde

Die Thermo Scientific Pierce ActivX -Desthiobiotin-GTP-Sonde markiert kovalent die aktive Stelle von GTPasen und GTPase-Untereinheiten von mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Dies ermöglicht ihre selektive Anreicherung und somit die Identifizierung und Profilierung von Zielenzymklassen über Proben hinweg sowie die Beurteilung der Spezifität und Affinität von Enzym-Inhibitoren.

Merkmale der ActivX Desthiobiotin-GTP-Sonde:

• Spezifisch – markieren Sie nur die konservierten Aktivstellen-Lysine von Nukleotid-Bindungsproteinen
• Kompatibel – zur In-vitro-Markierung von GTPase-Enzymen, die aus Zellen oder Geweben gewonnen werden.
• Flexibel – geeignet für Western Blot oder Massenspektrometrie(MS)-Arbeitsabläufe

Anwendungen der ActivX Desthiobiotin-GTP-Sonde:
• Breite Anreicherung von GTP-bindenden Proteinen aus Geweben, Zellen und subzellulären Proteomen
• Anreicherung von Enzymen basierend auf Funktion
• Profilierung von Dutzenden bis Hunderten von Hemmkörpern

Die ActivX Desthiobiotin-GTP-Sondenstruktur besteht aus einem modifizierten Biotin, das durch eine labile Acylphosphat-Bindung an das Nukleotid gebunden ist. Nach der Entfernung von GTP- oder GDP-Nukleotiden aus Enzymen kann die Desthiobiotin-GTP-Sonde verwendet werden, um konservierte Lysinrückstände an Nukleotid-Bindungsstelle der GTPase kovalent zu modifizieren. Desthiobiotin-GTP kann Zielenzymklassen selektiv in Proben anreichern, identifizieren und profilieren. Die Vorinkubation von Proben mit niedermolekularen Inhibitoren, die mit Sonden an aktiven Standorten konkurrieren, ermöglicht die Bestimmung der Bindungsaffinität und Zielspezifität von Inhibitoren.

Die Beurteilung der Aktivstellen-Markierung kann entweder mit Western Blot oder mit Massenspektrometrie (MS) erfolgen. Für den Western Blot-Ablauf werden desthiobiotin-markierte Proteine für die SDS-PAGE-Analyse und den anschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern angereichert. Für den MS-Ablauf werden Desthiobiotin-markierte Proteine reduziert, alkyliert und enzymatisch zu Peptiden verdaut. Nur die Peptide an den mit Desthiobiotin markierten, aktiven Stellen werden für die Analyse mit LC-MS/MS angereichert. Beide Arbeitsabläufe können zur Bestimmung der Bindung von Inhibitorzielen verwendet werden, aber nur der MS-Arbeitsablauf kann globale Inhibitorziele und Off-Targets identifizieren.

Weitere Produktdaten
• GTPase-Anreicherung mit einer neuen Aktivstellen-Sonde

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