Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)

Rendimiento probado: la referencia en fosfatasa
•100 % inactivado al calor en 15 minutos a 65 °C
•Estabilidad de almacenamiento mejorada significativamente a temperaturas más bajas (consulte la Fig. 1 y 2) 
•Actividad específica muy alta (consulte la Fig. 3)
•Elimina fosfatos 5’ de ADN, ARN, dNTP y proteínas 
•Purificado a partir de una fuente recombinante
•Puede añadirse directamente a las digestiones de enzimas de restricción 
•No es necesaria la purificación de vectores 
•No requiere cinc suplementario ni otros aditivos para la actividad 
•Funciona directamente en muchos tampones diferentes 
•Tratamiento sencillo de dNTP no incorporados en productos de PCR antes de la secuenciación de ADN o del análisis de SNP

USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)
La fosfatasa alcalina de camarón (SAP) es una fosfatasa alcalina de alto nivel de actividad específica, lábil al calor  purificada a partir de una fuente recombinante y aislada originalmente de Pandalus borealis (camarón ártico).  La fosfatasa alcalina de camarón (SAP) es útil en aplicaciones de biología molecular como la desfosforilación de los extremos fosforilados del ADN o ARN, para su uso posterior en la clonación o el etiquetado final de las sondas. En la clonación, la desfosforilación evita la relegación del ADN plasmídico linealizado. La SAP también se puede utilizar para tratar los dNTP no incorporados en reacciones de PCR para preparar plantillas para secuenciación de ADN o análisis de SNP.

La fosfatasa alcalina de camarón tiene aproximadamente la misma actividad específica que la fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP) y, al igual que la CIAP, está activa en prácticamente todos los tampones de reacción enzimática de restricción. A diferencia de la CIAP, la fosfatasa alcalina de camarón se inactiva total e irreversiblemente mediante reacciones de calentamiento a 65 °C durante 15 minutos.

La fosfatasa alcalina de camarón resulta especialmente útil en la preparación de productos de PCR para aplicaciones que impliquen secuenciación, análisis de SNP o etiquetado. Normalmente, los excesos de dNTP que quedan después de la PCR interfieren en las reacciones enzimáticas posteriores que conlleva la síntesis de ADN. La SAP desfosforila todos los dNTP restantes de la mezcla de PCR en un solo paso.

Nos complace ofrecer una versión recombinante de nuestro análisis de referencia de fosfatasa. La SAP recombinante elimina la dependencia del origen animal y ofrece las ventajas adicionales de una mayor estabilidad del almacenamiento y uniformidad entre lotes, al tiempo que le brinda una actividad enzimática excepcional y una inactivación al calor al 100 %.

Propiedades:
Peso molecular: Homodímero. El monómero es de 55 kDa determinado por la secuencia de aminoácidos.
pH óptimo: 10,4 en tampón de glicina y pH 8,0 en tampón de Tris.
Temperatura óptima: 37 °C
Inactivación por calor: 65 °C durante 15 min.
Inhibidores: DTT de 10 mM, β-ME al 0,1 %
Condiciones de reacción: Se activo en NaCl, KCl. Requiere Mg²⁺ para mayor actividad.

Origen:
Recombinante

Pureza:
Probado para endonucleasas, exonucleasas y ribonucleasas contaminantes.

Tampón de almacenamiento:
Tris-HCl de 25 mM (pH 7,5), 1 mM de MgCl2, glicerol al 50 %.

Condiciones del ensayo:
La mezcla de reacción contiene 100 mM de glicina, pH 10,4, 1 mM de MgCl₂, 1 mM de ZnCl₂, 10 mM de p-nitrofenil fosfato y 0,001-0,1 unidades de fosfatasa alcalina de camarón (SAP). Se monitoriza el cambio de absorbancia a 405 nm (volumen de reacción de 3050 μl).

Definición de unidad:
Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de 1 μmol de fosfato de p-nitrofenilo por minuto en un tampón de glicina (pH 10,4) a 37 °C.

Concentración:
1 unidad/μl

Prueba funcional:
Desfosforilación de plásmidos digeridos por enzimas de restricción (5–20 pmol de extremos 5', 0,1-0,5 unidades/pmol de extremos 5'). Reduce la relegación a < 0,5 % en comparación con el control sin tratar.

PROTOCOLO PARA LA DESFOSFORILACIÓN DE NUCLEÓTIDOS Y LA DEGRADACIÓN DE CEBADORES ANTES DE LAS REACCIONES DE SECUENCIACIÓN O ANÁLISIS DE SNP:
Consulte el protocolo de USB ExoSAP-IT, la referencia en limpieza de PCR.

La compra de ExoSAP-IT proporciona una licencia para los métodos de limpieza de PCR mediante Exonucleasa I y SAP.

Tampón de reacción SAP 10X probado funcionalmente (incluido, n.º de ref. 70103):
200 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM₂ de MgCl.

Tampón de dilución SAP probado funcionalmente (1 ml incluido, n.º de ref. 72761):
50 mM de Tris-HCl (pH 8,0).

Referencias:
1. RUAN, C. C., SAMOLS, S. B. AND FULLER, C. W. (1990) Comments 17, (No.1), United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH.
2. WERLE, E., SCNEIDER C., RENNER, M., VÖLKER, M. AND FIEHN, W. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4354-4355.
3. HANKE, M. AND WINK, M. (1994) BioTechniques 17, 858-860.