El kit APO-DIRECT™ es un método de tinción de dos colores para el etiquetado de roturas del ADN y del ADN total celular para detectar células apoptóticas mediante citometría de flujo. El kit contiene las instrucciones y los reactivos necesarios para la medición de la apoptosis celular, es decir: células de control positivas y negativas para evaluar el rendimiento del reactivo; tampones de lavado, de reacción y de aclarado para procesar pasos individuales del ensayo; enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT); fluoresceína desoxiuridina trifosfato y solución de yoduro de propidio/ARNasa A para la contratinción del ADN total.
Una de las características más fácilmente mensurable de las células apoptóticas es la ruptura del ADN genómico por las nucleasas celulares. Estos fragmentos de ADN se pueden extraer de células apoptóticas y producir la aparición de escaleras de ADN cuando se analiza por electroforesis en gel de agarosa. El ADN de células no apoptóticas, que permanece prácticamente intacto, no muestra este patrón de escalera en electroforesis en geles de agarosa. El gran número de fragmentos de ADN que aparecen en las células apoptóticas resulta en una multitud de terminaciones 3'-hidroxilo en el ADN. Esta propiedad se puede utilizar para identificar las células apoptóticas mediante el marcado de las terminaciones 3'-hidroxilo con nucleótidos de fluoresceína desoxiuridina trifosfato (FITC-dUTP) directamente conjugados. La encima desoxinucleotidil transferasa (TdT) cataliza una adición independiente de plantillas de desoxirribonucleósidos trifosfato a las 3 terminaciones del ADN bicatenario o monocatenario con extremos romos, ahuecados o salientes. Hay un número considerable de estas ubicaciones en células apoptóticas, lo que supone la base del método que se utiliza con el kit APO-DIRECT™. Las células no apoptóticas no incorporan cantidades significativas del FITC-dUTP debido a la falta de terminaciones expuestas de ADN 3'-hidroxilo.
Se suministra suficiente reactivo como para procesar 50 suspensiones de células y se incluyen 5 ml de suspensión de células de control positivo y 5 ml de negativo de aproximadamente 1 x 106 células por ml en etanol al 70 % (v/v).
Aplicación declarada
Inmunocitoquímica, análisis citométrico de flujo
Para uso exclusivo en investigación