Pierce™ Protein Refolding Kit

El kit de replegamiento de proteínas Thermo Scientific Pierce contiene reactivos de gran pureza e instrucciones detalladas para utilizar una estrategia de matriz con la que determinar las condiciones de tampón óptimas para replegar proteínas recombinantes que han sido desnaturalizadas y solubilizadas a partir de cuerpos de inclusión.

Características del kit de replegamiento de proteínas:

• Robusto: las condiciones y los componentes examinados se limitan a los de mayor utilidad general como tampones de plegado
• Práctico: diseño de matriz de tres niveles que reduce de forma significativa la optimización secundaria exigida y aumenta la facilidad de interpretación de los datos
• Formato de matriz ajustable: permite adaptar los experimentos de replegamiento en función de la proteína diana; resuelve las interacciones negativas y positivas conocidas entre los componentes del tampón y reduce los análisis innecesarios
• Reactivos de gran pureza: los reactivos se han formulado siguiendo estándares rigurosos que garantizan la coherencia de los resultados

El kit contiene los reactivos esenciales y una estrategia completa para determinar las condiciones óptimas de tampón para replegar las proteínas recombinantes desnaturalizadas y restaurar así la estructura y función nativas. Nueve tampones de replegado base forman una matriz que incluye un rango de condiciones desnaturalizantes fuertes y débiles para suprimir la agregación de proteínas. Los aditivos suministrados se utilizan como factores de matriz adicionales, dependiendo del tipo de proteína que se vaya a replegar. Los componentes del tampón se examinan bajo tres niveles de concentración distintos, lo que permite probar un amplio espectro de condiciones de plegamiento en un mismo experimento. El diseño ajustable permite adaptar las condiciones de la matriz a la proteína diana, de forma que se reduzcan los residuos de muestras y los análisis innecesarios al tiempo que se maximice el rendimiento del replegamiento. El kit de replegamiento de proteínas Pierce se suministra con una completa guía de replegamiento que incluye detalles sobre aislamiento, solubilización y purificación de cuerpos de inclusión, optimización de condiciones de replegamiento y análisis de resultados.

Nota: La siguiente sección se basa en el artículo original de las revisiones previas que informó sobre el desarrollo del kit de replegamiento de proteínas Pierce, que originalmente se llamaba «Pro-Matrix».

Métodos
La lisocima se desnaturalizó durante la noche a 4 °C en 8 M de GdnHCl, 10 mM de DTT, 50 mM de Tris, con pH 8,0 a 20 mg/ml. Se añadió glutatión reducido, glutatión oxidado y DTT a los tampones de replegamiento, según lo determinado por el diseño de la matriz (tabla 3). Todas las soluciones se equilibraron a 4 °C. Inmediatamente antes de añadir lisocima solubilizada a los tampones de replegamiento, la DTT se retiró utilizando una columna de centrifugación desaladora de proteínas equilibrada en GdnHCl de 8 M, 50 mM de Tris; pH 8,0. A continuación, se añadió lisocima a los tampones de replegamiento a una concentración final de 1 mg/ml. Esta adición suministra 0,4 M de GdnHCl a los tampones de replegamiento base. Se permitió el replegamiento durante 18 horas a 4 °C. La producción de replegamiento se determinó midiendo la actividad de la lisozima con el kit de ensayo de lisozimas EnzChek(tm) (Molecular Probes) utilizando un sistema Tecan(tm) SPECTRAFluor Plus.

Resultados y discusión
El protocolo básico para el replegamiento de proteínas requiere primero que los cuerpos de inclusión se aíslen, purifiquen y luego solubilicen con un desnaturalizante fuerte, como el clorhidrato de guanidina (GdnHCl), para producir una proteína completamente desplegada. La proteína solubilizada se diluye o dializa en un tampón de replegamiento para reducir la concentración de desnaturalizantes, lo que permite que la proteína se repliegue en función de la información contenida en su secuencia primaria. Cuando se utilizan en condiciones optimizadas, muchas proteínas pueden replegarse de forma fiable a concentraciones de > 1 mg/ml. Sin embargo, si se elimina el desnaturalizante y se reemplaza por un tampón de replegamiento no optimizado, la agregación de proteínas compite con fuerza con la renaturalización y solo se recuperan cantidades mínimas de proteína nativa. El grado de agregación que se produce durante el replegamiento depende en gran medida de la concentración de proteínas, la concentración de desnaturalizantes fuertes y débiles, el pH, la temperatura y el ámbito redox. La fuerza iónica, los cationes divalentes, los polímeros y los cofactores también pueden promover el replegado de algunas proteínas.

Los resultados del replegado de lisozima reducida y desnaturalizada con el kit de replegado de proteínas Pierce se indican en la tabla 3. Para este ejemplo tratamos la lisozima como si la presencia de enlaces de disulfuro en el estado nativo fuera desconocida. La reformación de la lisozima nativa se suprimió con las concentraciones de desnaturalizantes más bajas y más altas presentes en la matriz de replegado de la proteína (números de ensayo 1, 2 y 9). El replegado también se suprimió por la presencia de TDT (números de ensayo 1, 6 y 8), lo que demuestra la importancia de reformar los enlaces de disulfuro en el plegado de la lisozima. La mayor actividad de lisozima recuperada en el experimento se consiguió en el ensayo siete, que contenía 1,4 m GdnHCl, 0 m L-arginina, 2 mm GSH: 0,4 mm GSSG y representa más del 90 % de la lisozima solubilizada que se estaba replegando.