El panel Multiplex de vía AKT (fosfo) Thermo Scientific SureQuant (cuantificación absoluta) proporciona una solución de cuantificación completa para el enriquecimiento y análisis de eventos clave de fosforilación de las proteínas de la vía de señalización de AKT mediante espectrometría de masas (MS).

El panel Multiplex de vía AKT (fosfo) SureQuant (cuantificación relativa) consta de dos módulos:
• El módulo de preparación de muestras de vía AKT (fosfo) SureQuant IP y MS incluye reactivos necesarios para el inmunoenriquecimiento de las proteínas fosforiladas de la vía AKT-mTOR y realizar la preparación de muestras MS en solución desde muestras de lisis hasta la limpieza de péptidos
• El módulo de cuantificación absoluta de vía AKT (fosfo) SureQuant incluye un estándar de idoneidad del sistema para monitorizar el rendimiento de MS, las mezclas AQUA Ultimate HeavyPeptide y LightPeptide para la cuantificación absoluta de péptidos, y métodos para el uso de instrumentos Thermo Scientific Q Exactive y Fusion Tribrid e instrumentación Nanospray LC

Las características del panel Multiplex de vía AKT (fosfo) SureQuant incluyen:
• Completo: contiene todos los reactivos para supervisar con éxito el rendimiento del sistema MS, la preparación de las muestras y la cuantificación absoluta de las proteínas y los péptidos diana
• Validado: los anticuerpos, péptidos y lisados de control han pasado por pruebas rigurosas para determinar el grado de especificidad y cuantificación correcta de cada péptido diana
• Multiplex: capaz de cuantificar la fosforilación de diez proteínas clave en la vía de señalización AKT
• Flexible: el formato modular permite únicamente el inmunoenriquecimiento, o en combinación con cuantificación relativa o absoluta

La vía de señalización AKT sirve como guía maestra reguladora para el crecimiento y la proliferación celular, y la fosforilación juega un papel clave en su modulación. La activación aberrante de esta vía promueve la supervivencia de las células tumorales en muchos tipos de cáncer. Este kit multiplex es ideal para supervisar la expresión de proteínas de 10 proteínas fosforiladas clave en la vía de señalización AKT (AKT, PTEN, IRS1, IGF1-R, GSK3a, GSK3b, PRAS40, mTOR, p70S6K y TSC2) en un solo ensayo. La capacidad de supervisar y cuantificar simultáneamente estas dianas en una sola muestra la convierte en una potente herramienta de evaluación de la señalización normal y anormal de la vía.

El módulo de preparación de muestras (fosfo) de la vía AKT SureQuant IP y MS permite una inmunoprecipitación (IP) y una coinmunoprecipitación (co-IP) de antígenos altamente eficaces para el análisis de MS. Primero, las células se lisan y se incuban con una mezcla de anticuerpos biotinilados verificada por IP-MS. El complejo anticuerpo-antígeno se captura en gránulos magnéticos de estreptavidina compatibles con MS con proteínas no específicas eliminadas mediante el lavado con tampones compatibles con MS. Las proteínas diana se eluyen mediante tripsina y son directamente compatibles con la preparación de muestras de MS. La preparación de la muestra de MS se ha agilizado y se puede completar en ∼4 horas para el análisis de MS en el mismo día.

El módulo de cuantificación absoluta (fosfo) de la vía AKT SureQuant proporciona reactivos para la cuantificación absoluta de 30 péptidos únicos a partir de 10 proteínas fosforiladas diana de la vía de señalización AKT-mTOR mediante cromatografía líquida (LC) y MS. La mezcla AQUA Ultimate HeavyPeptide, la mezcla AQUA Ultimate LightPeptide y los reactivos de la digestión de proteínas Pierce 6 equimolares de grado LC-MS se utilizan para generar una curva estándar en una matriz, y las diluciones en serie realizadas por el usuario se han optimizado para abarcar 2–3 órdenes de magnitud (de 200 a 0,03 fmol en columna). Se proporcionan métodos estandarizados y plantillas de proceso de datos para agilizar la adquisición y el análisis de datos.

En este módulo se incluye el estándar de idoneidad del sistema de LC-MS/MS Pierce (mezcla de 7 x 5) para evaluar el rango dinámico de los sistemas de LC-MS/MS antes de ejecutar las curvas de calibración y las muestras.

Juntos, estos módulos proporcionan una solución completa para la preparación de muestras y el análisis de las proteínas diana fosforilizadas en la vía.

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