Kit de transcripción mMESSAGE mMACHINE™ SP6

Los kits mMESSAGE mMACHINE™ están diseñados para la síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN con caperuza. El ARN con caperuza imita a la mayoría del ARN mensajero (ARNm) eucariótico encontrado in vivo porque tiene una estructura de caperuza de 7-metil guanosina en el extremo 5'. El kit mMESSAGE mMACHINE™ incluye un análogo de la caperuza [m⁷G(5')ppp(5')G] en una reacción de transcripción de producción extremadamente elevada. El análogo de la caperuza solo se incorpora como primer terminal o terminal G 5' de la transcripción porque su estructura impide su incorporación en cualquier otra posición en la molécula de ARN.

Funcionamiento del kit mMESSAGE mMACHINE™
Los kits mMESSAGE mMACHINE™ tienen un formato de reacción simplificado en el que los cuatro ribonucleótidos y el análogo de la caperuza se mezclan en una sola solución. La proporción de análogo de la caperuza:guanosín trifosfato (GTP) de esta solución es de 4:1, lo que es óptimo para maximizar tanto la producción de ARN como la proporción de transcripciones con caperuza. Los kits mMESSAGE mMACHINE™ son ideales para la síntesis rutinaria de ARN con caperuza por microinyección de ovocitos, traslación in vitro, transfección y otras aplicaciones. La elevada producción se consigue al optimizar las condiciones de reacción para la síntesis de ARN en presencia de altas concentraciones de nucleótidos. Además, el ARN sintetizado está protegido de la degradación por cualquier ribonucleasa contaminante que pueda estar presente gracias al inhibidor de ARNasa, componente de la mezcla de enzimas.

Uso de los kits mMESSAGE mMACHINE™
En una reacción de 20 µl durante 2 horas de incubación, la transcripción de ARN con caperuza de alto rendimiento de mMESSAGE mMACHINE™ producirá grandes cantidades de masa de ARN con caperuza. Entre 10 y 50 veces la producción obtenida con reacciones de transcripción in vitro convencionales. La proporción de análogo de la caperuza y GTP se ha optimizado para posibilitar la mejor relación entre el rendimiento (de 15 a 35 µg) y la proporción de transcripciones con caperuza (80 %). Los kits mMESSAGE mMACHINE™ también contienen una solución de precipitación de cloruro de litio (LiCl) que es eficaz para separar proteínas y nucleótidos sin incorporar (incluido el análogo de la caperuza libre) del ARN con caperuza, lo que mejora la eficacia de la traslación. Los kits mMESSAGE mMACHINE™ solo están optimizados para su uso con las polimerasas incluidas en el kit. El uso de otra polimerasa distinta podría producir rendimientos bajos. Los kits mMESSAGE mMACHINE™ contienen todos los tampones y reactivos necesarios para 25 reacciones de transcripción. Con la plantilla de control suministrada con los kits (factor de elongación Xenopus 1α, pTRI Xef), cada reacción de mMESSAGE mMACHINE™ producirá aproximadamente entre 20 y 30 µg de ARN con la ARN polimerasa T3 o T7 o aproximadamente entre 15 y 25 µg de ARN con la ARN polimerasa SP6.