El kit Ambion™ Cells-to-cDNA™ II (patente pendiente) produce ADNc a partir de células de mamíferos cultivadas en menos de dos horas. No se requiere aislamiento de ARN. Este kit contiene suficientes reactivos para 100 reacciones y es ideal para quienes deseen realizar reacciones de transcripción inversa en pequeñas cantidades de células, numerosas muestras de células, o para científicos que no están familiarizados con el aislamiento de ARN.

• No se requiere purificación de ARN
• De células en cultivo hasta ADNc en menos de dos horas
• Detecte mensajes raros en tan solo una célula
• Ideal para laboratorios no equipados para aislamiento de ARN

Ideal para aplicaciones de RT-PCR
El kit Cells-to-cDNA™ II (pendiente de patente) integra la inactivación de RNasa y el tratamiento con DNasa I en un tampón de lisis celular compatible con RT-PCR, eliminando el aislamiento de ARN por completo. La mayoría de los tampones de lisis celular contienen desnaturalizantes fuertes que si se llevan a las reacciones enzimáticas inhibirían o inactivarían la mayoría de las enzimas. Si se utiliza un tampón de lisis sin desnaturalizantes fuertes, la RNasa endógena puede degradar rápidamente el ARN celular. El kit Cells-to-cDNA™ II contiene un novedoso tampón de lisis celular que inactiva RNasas endógenas sin comprometer las reacciones enzimáticas posteriores. Después de la inactivación de las RNasas, el lisado celular puede añadirse directamente a una reacción de síntesis de ADNc. Cells-to-cDNA™ II es compatible con protocolos RT-PCR de un paso y de dos pasos.

Cuantitativo: resultados lineales y ausencia de contaminación por ADN detectable
Para ilustrar la respuesta cuantitativa y lineal de Cells-to-cDNA™ II a las variaciones en el número de células de entrada, se realizó un experimento cuantitativo de RT-PCR en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI 7700. El trazado del umbral de ciclo (CT) frente a la concentración celular para la GAPDH produjo una curva estándar con una correlación de 0,99. Por lo tanto, Cells-to-cDNA™ II produce resultados lineales para 1 a 10 000 células/µl en un ensayo de RT-PCR en tiempo real de dos pasos. También debe tenerse en cuenta que el control de PCR con plantilla negativa para el experimento de la GAPDH fue negativo, lo que indica la eliminación completa del ADN genómico.

Procedimiento simple
El kit incluye todo lo que necesita para pasar de células cultivadas a ADNc preparado para PCR en menos de dos horas; no se requiere aislamiento de ARN. Primero, las células se lavan con PBS y luego se resuspenden en el tampón de lisis celular. Un calentamiento breve lisa las células simultáneamente e inactiva las ARNasas. A continuación, se realiza una digestión opcional de la ADNasa para degradar el ADN genómico, seguida de un paso de inactivación por calor. Una fracción del lisado celular se utiliza en una reacción de transcripción inversa con los reactivos incluidos.

Productos accesorios:
Se recomienda la ADN polimerasa Taq termoestable SuperTaq™, disponible por separado (SKU n.º AM2050 y AM2052). Para una amplificación óptima de fragmentos superiores a 1 kb, utilice la ADN polimerasa Taq termoestable SuperTaq™ Plus (SKU n.º AM2054 y AM2056).