El kit de vectores de expresión de ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ combina las ventajas de los vectores de ARNi tradicionales (expresión estable y capacidad para utilizar la inserción viral) con las capacidades para la expresión específica de tejidos y la reducción de varios objetivos de la misma transcripción El vector pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR incluido en el kit de vectores de expresión de ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ con proteína fluorescente verde esmeralda está diseñado para expresar miARN artificiales que están diseñados para tener el 100 % de homología con la secuencia objetivo y darán lugar a la escisión específica. Este vector incluye secuencias de flancos y bucles de un miARN endógeno que dirige la escisión del miARN diseñado a partir de una transcripción de Pol II más larga (precursor de miARN). Con el galardonado diseñador de ARNi BLOCK-iT™ de Invitrogen, más del 70 % de las construcciones producen más de un 70 % de reducción. La expresión Pol II de miARN diseñados permite:
o Fuerte expresión del promotor inmediato-precoz del CMV, con la opción de utilizar promotores específicos de tejidos u otros promotores regulados a través de la recombinación MultiSite Gateway™
o Expresión cocistrónica de un indicador de proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP) en el vector pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR, que da como resultado una correlación muy fuerte de la expresión de la EmGFP con la actividad de reducción del miARN
o Compatibilidad con muchos de los vectores de destino (DEST) Gateway de Invitrogen™ para la expresión génica; entre los que se incluyen: vectores lentivirales para la transducción estable de tipos celulares primarios, sin división y con división, el sistema Flp-In™ para la integración cromosómica de un solo sitio y construcciones de fusión de indicador alternativas
o Expresión de más de un miARN diseñado en la misma transcripción, lo que permite la reducción de varios genes de forma simultánea y la generación de fenotipos sintéticos
Cómo funciona
Para altos niveles de expresión de la secuencia ARNi miR, el vector pcDNA™6.2-GW/miR incluye el promotor de CMV (Figura 1). Basta con introducir un número de acceso RefSeq o una secuencia de nucleótidos en el diseñador de ARNi BLOCK-iT™ (en línea y gratuito) y el software diseñará miARN optimizados que tengan el 100 % de homología con el objetivo de interés. Clone el miARN en el vector con un protocolo de ligación rápida y realice la transfección para la expresión inmediata del miARN. La maquinaria celular endógena del núcleo (incluida Drosha) procesa el miARN expresado, que se transporta al citoplasma donde Dicer continúa con su procesamiento (Figura 2). El miARN completamente procesado se incorpora entonces al RISC en el que funciona como un ARNip y da como resultado la escisión del ARNm objetivo.
Para una variedad de opciones de expresión, el casete de miARN que contiene EmGFP, las regiones de flanqueo de miR y un miARN homólogo al objetivo de interés, se pueden mover fácilmente a una variedad de vectores DEST. Esto ocurre a través de reacciones de recombinación Gateway™ en las que el casete de miARN se transfiere a un vector pDONR™ (reacción BP) y luego a un vector DEST (reacción LR) de elección.