El kit Thermo Scientific Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylation contiene reactivos para un marcado del ARN con destiobiotina fácil y eficaz para su uso como sondas o como alternativa a los anticuerpos en el enriquecimiento de proteínas que se une a ARN.

Características del kit de RNA 3'-End Desthiobiotinylation:

• No radioactivo: una única etiqueta de biotina tiene una sensibilidad de detección similar a la radioactividad
• Facilidad de uso: incluye la ARN ligasa y el tampón de reacción optimizado
• Económico: solo pagará una parte del precio si compra las sondas de ARN biotiniladas sintéticas
• Extremo etiquetado: da lugar a alteraciones mínimas de la estructura secundaria del ARN
• Flexible: la etiqueta de destiobiotina puede usarse para la detección o como soporte de afinidad para la resina con estreptavidina

El kit Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylation se ha optimizado para el marcado del extremo 3' de ARN de cadena sencilla usando la ARN ligasa de T4. Una vez marcado, el ARN puede usarse como sonda o diana para reacciones EMSA gel-shift, método Northern y experimentos de interacción proteína-ARN. El ARN destiobiotinilado también puede usarse para el enriquecimiento en proteínas de unión a ARN (RBP) usando una resina de afinidad a estreptavidina, debido a que la etiqueta de destiobiotina se une a la estreptavidina de forma que permite una elución suave del complejo ribonucleoproteína. El kit de marcado también se incluye como componente del Thermo Scientific Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit.

Incluye:
Bifosfato de citidina destiobiotinilado, ARN ligasa de T4 y tampón, oligonucleótido de ARN no marcado como control positivo, patrón de sonda de ARN biotinilado, inhibidor de ARNasas, glucógeno y reactivos para potenciar la ligación

Aplicaciones:
• Northern blotting
• EMSA
• Enriquecimiento de proteínas de unión a ARN (RBP)

Este kit de marcado de ARN utiliza la ARN ligasa de T4 para unir una única molécula de bifosfato de citidina destiobiotinilado en el extremo 3' del ARN de cadena sencilla. Cada reacción de marcado está diseñada para 50 pmoles de ARN; sin embargo, las reacciones pueden ampliarse (se han probado de 1 pmoles a 1 nmoles), si es necesario. La reacción utiliza un exceso 20 veces superior de nucleótido destiobiotinilado y requiere tiempos de incubación de 30 minutos a 37 °C (para los ARN menos complejos) a durante toda la noche a entre 4 y 16 °C (para ARN más largos o complejos). La optimización de la eficacia del marcado para estructuras de ARN complejas se consigue alterando la relación ARN:nucleótido, aumentando el tiempo de incubación o añadiendo DMSO para abrir la estructura del ARN. Tras la extracción orgánica y la precipitación con etanol, el ARN marcado con destiobiotina está listo para su uso en aplicaciones posteriores.

Los ejemplos de experimentos con diferentes moléculas de ARN muestran la solidez de la reacción de ligación. Se evaluaron el ARN sintético y transcrito in vitro y se determinaron las eficacias de ligación mediante dot blot semicuantitativo usando un ARN biotinilado sintético como control de marcado 100 % (Tabla). Las eficacias de ligación eran todas superiores al 50 % y muchas de ellas se encontraban por encima del 70 %. El ARN control del kit presentaba una eficacia superior al 90 % y servía como indicador de las condiciones generales de reacción y de los reactivos. Fue necesaria una optimización adicional en el caso de ARN con una estructura secundaria significativa, y se requirió un replegamiento para el ARN transcrito in vitro después de la ligadura.

La prueba de purificación mediante interacción ARNmi let-7:Lin28 demostró la funcionalidad experimental del ARN marcado destiobiotinilado. La proteína Lin28 regulada durante el desarrollo es un inhibidor selectivo del procesamiento del ARNmi let-7 a través de la unión a una región lazo del pre-ARNmi let-7. Para comprobar esta interacción, la porción lazo del ARNmi let7 se marcó en su extremo terminal con citidina destiobiotinilada y se unió a microesferas magnéticas de estreptavidina. Las microesferas se incubaron posteriormente con lisado de células de carcinoma embrionario (NCCIT) en tampón de unión proteína-ARN. Las muestras se eluyeron y estudiaron mediante método de Western blot. Los resultados indican que el miARN de let-7 etiquetado enriqueció específicamente la proteína Lin28 del lisado de NCCIT; mientras que un ARN no relacionado, no.

Este kit también se incluye en el kit Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down y utiliza el kit de etiquetado junto con tampones de unión, lavado y elución optimizados para enriquecer las proteínas de unión de ARN.