Thermo Scientific Pierce Monomere Avidin Agarose eignet sich hervorragend zur Reinigung von biotinylierten Proteinen, Peptiden und anderen Molekülen.
Merkmale der monomeren Avidin-Agarose:
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Nicht denaturierend – Reinigt biotinylierte Produkte unter milden Elutionsbedingungen (2 mM freies Biotin)
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Wiederverwendbar – Monomere Avidin-Agarose kann mindestens 10-mal regeneriert und wiederverwendet werden, wobei nur ein marginaler Verlust an Biotin-Bindungskapazität (ca. 2,5 % Abnahme pro Regeneration) zu verzeichnen ist
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Spezifisch – Behält Biotin-Bindungsspezifität und geringe unspezifische Bindung von nativem Avidin bei
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Flexibel – Proben in einer Vielzahl von physiologischen Puffern binden und eluieren, entweder mit 0,1 M Glycin oder in Konkurrenz mit 2 mM Biotin
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Gute Bindungskapazität – Größer als 1,2 mg biotinyliertes BSA/ml Harz
Das immobilisierte, monomere Avidin bindet Biotin mit hoher Spezifität und moderater Affinität. Auf diese Weise ist es möglich, erst die nicht biotinylierten Moleküle durch Wäsche zu entfernen und anschließend die Biotin-markierten Moleküle mit 2 mM Biotin in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) kompetitiv zu eluieren. Diese Technik bietet die schonendsten Elutionsbedingungen für die Reinigung von biotinylierten Proteinen und vermeidet die Kontamination und andere Probleme, die mit herkömmlichen Avidin- und Streptavidin-Methoden verbunden sind. Die monomere Avidin-Säule kann dann mit 0,1 M Glycin regeneriert werden, um die gebundenen Biotinreste abzulösen, ohne die Fähigkeit zu verlieren, eine weitere biotinylierte Probe zu binden.
Mit typischem Avidin oder Streptavidin ist die Biotin-Bindungsaffinität (Kd = 10
–15 M) so groß, dass die Aufreinigung mit diesen herkömmlichen Medien Denaturierungsbedingungen für die Elution erfordert, wie z. B. 8 M-Guanidin·HCl bei pH 1,5 oder Kochen in reduzierendem SDS-PAGE-Probenladepuffer. Neben den unerwünschten Wirkungen dieser Mittel auf die interessierenden biotinylierten Proteine verursachen solche aggressiven Elutionsbedingungen in der Regel Verunreinigungen, denn unerwünschte Proteine (wie z. B. Avidin- oder Streptavidin-Untereinheiten) können vom Harz abgelöst werden und zusammen mit dem gewünschten Reinigungsprodukt eluiert werden. Wenn Avidin dagegen als Subunit-Monomer an ein Harz (z. B. quervernetzte Agarosebeads oder UltraLink Harz) gekoppelt wird, bleibt seine Spezifität für Biotin erhalten, aber seine Biotin-Bindungsaffinität verringert sich auf ein Niveau (Kd = 10
–8 M), das der nachfolgenden Elution förderlich ist.
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