Das Thermo Scientific Pierce Vernetzungs-IP-Kit passt die herkömmliche IP-Methode an, indem es Reagenzien und Protokolle zur Vernetzung von IP-Antikörpern mit Protein A/G-Agarose aufnimmt und so eine Antigen-Immunpräzipitation ohne Antikörperkontamination ermöglicht.
Die primären Vorteile aufgrund dieser Möglichkeit sind die Aufreinigung von Zielprotein ohne Kontamination durch die Antikörper und eine effizientere Wäsche und Trennung von Proben aus Agaroseharz-Beads.
Merkmale des Vernetzungs-IP-Kits:
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Keine Antikörperkontamination: Der Antikörper ist irreversibel an die Agarose-Beads gebunden, sodass die Co-Elution von schweren und leichten Ketten mit dem gereinigten Protein minimiert wird
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Einfache und effiziente Skalierbarkeit: Verwenden Sie nur die Menge an Antikörpern, die für ein einzelnes IP-Experiment erforderlich ist, oder immobilisieren Sie 100 bis 200 µg Antikörper, um gebrauchsfertiges IP-Affinitätsharz für eine Vielzahl von Experimenten vorzubereiten
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Assay-Zuverlässigkeit und Probenhandhabung: Pierce Spin-Säulen beseitigen Harzverlust und sorgen für eine effizientere Trennung von Lösungen als herkömmliche IP-Methoden, die nur Mikrozentrifugenröhrchen verwenden
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Vorbereitetes Antikörperaffinitätsharz ist mehrfach einsetzbar: Da der Antikörper kovalent immobilisiert ist und durch das schonende Elutionsverfahren normalerweise nicht inaktiviert wird, kann das Harz oft mehrmals verwendet werden
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Komplett-Kits: Das Paket enthält ausreichend Reagenzien und Spin-Säulen für mindestens 50 Antikörperimmobilisierungen und IP-Experimente
Anwendungen:• Immunpräzipitation, gefolgt von Elektrophorese und Exzision des Proteins für die Massenspektrometrie oder Bestimmung mittels Sequenzanalyse
• Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse eines Zielproteins, dessen Molekulargewicht ähnlich schwer ist wie die leichten oder schweren Ketten des Antikörper-Fragments
• Immunpräzipitation der Zielproteine für die nachfolgende Analyse mit nicht denaturierenden Methode (d. h. Methoden, die nicht auf SDS-PAGE beruhen)
Die Methode des Pierce Vernetzungs-IP Kits beinhaltet das Einfangen des IP-Antikörpers an Protein A/G-Agarose-Harz und seine kovalente Immobilisierung durch Vernetzung mit Disuccinimidylsuberat (DSS). Das Antikörperharz wird dann mit der Probe inkubiert, die das Protein-Antigen von Interesse enthält, wodurch sich der Antikörper/Antigen-Komplex bilden kann. Nach einem Waschverfahren zur Entfernung nicht gebundener (vermutlich unerwünschter) Bestandteile der Probe wird das Antigen durch die Dissoziation vom Antikörper mit dem Elutionspuffer des Kits wiedergewonnen. Das gesamte Verfahren erfolgt in einem Mikrozentrifugen-Becher, wodurch Lösungen nach einer kurzen Zentrifugation vollständig vom Agaroseharz getrennt werden. Durch das Verfahren wird nur Antigen eluiert, das ohne Störungen durch Antikörperfragmente identifiziert und weiter analysiert werden kann. Darüber hinaus kann das Antikörper-Harz oft für weitere Immunpräzipitationsläufe wiederverwendet werden.
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