Thermo Scientific T4 DNA Ligase beschleunigt katalytisch die Ausbildung einer Phosphodiester-Bindungsstelle zwischen nebeneinander liegenden 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Kettenenden in Duplex-DNA bzw. -RNA. Das Enzym repariert einsträngige Einbrüche (sog. „Nicks“) in Duplex-DNA und -RNA oder DNA/RNA-Hybriden. Verbindet auch DNA-Fragmente mit entweder kohäsiven oder stumpfen Enden, hat aber keine Wirkung auf einzelsträngige Nukleinsäuren.

T4 DNA-Ligase erfordert ATP als Kofaktor.

Highlights

• Aktiv in Thermo Scientific Restriktionsenzym-, PCR- und RT-Puffern (wenn ergänzt mit ATP)
• schnell — die Sticky-End-Ligation ist innerhalb von 10 Minuten bei Raumtemperatur abgeschlossen
• Lieferung mit PEG-Lösung für effiziente Ligation mit stumpfem Ende

Anwendungen

• Klonierung von Restriktionsenzymen erzeugt DNA-Fragmente
• Klonierung von PCR-Produkten
• Verbindung von doppelsträngigen Oligonukleotid-Linkern oder Adaptern mit DNA
• ortsspezifische Mutagenese
• Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
• Ligase-vermittelter RNA-Nachweis (siehe Referenz 3)
• Nick-Reparatur in Duplex-DNA, RNA oder DNA/RNA-Hybriden
• Selbstzirkulation linearer DNA.

Enthält

• T4 DNA-Ligase
• 10X T4 DNA-Ligase-Puffer
• 50 % PEG-Lösung

Hinweise

• Die Bindung von T4 DNA-Ligase an DNA kann zu einer Bandverschiebung in Agarosegelen führen. Um dies zu vermeiden, die Proben mit 6X DNA-Ladefarbstoff & SDS-Lösung 5 Minuten lang bei 70 °C oder 10 Minuten lang bei 65 °C inkubieren und dann vor der Elektrophorese auf Eis kühlen.
• Bei der Transformation darf das Volumen des Ligationsreaktionsgemischs das Volumen der kompetenten Zellen nicht um mehr als 10 % überschreiten.
• Vor der Elektrotransformation ist die T4 DNA-Ligase mithilfe von Zentrifugationssäulen oder Chloroform-Extraktion aus der Ligationsmischung zu entfernen. Die extrahierte DNA kann noch weiter mit Ethanol ausgefällt werden.