Invitrogen™ Anza™ alkalische Phosphatase ist für die Entfernung von 3'- und 5'-Phosphatgruppen vorgesehen, die nach dem Anza™ Restriktionsenzymverdau verbleiben, z. B. für die Dephosphorylierung von Vektoren vor der Insert-Ligation und der Entfernung von 5′ Phosphaten vor der Endmarkierung. Da die 5′ Phosphatgruppe für die DNA-Ligation erforderlich ist, verhindert die Behandlung von Vektoren mit Anza alkalischer Phosphatase eine Selbstligation und Rezirkulation, was zu einem verringerten Vektorhintergrund beim Klonen führt.

Merkmale der Anza alkalischen Phosphatase:

• Validiert für die Verwendung mit allen Anza Restriktionsenzymen
• dephosphoryliert in 15 Minuten bei 37°C
• Hitzeinaktiviert nach 5 Minuten bei 80 °C
• vollständig aktiv in Anza Buffer
• dephosphoryliert alle Arten von DNA-Enden (stumpf, 5'- und 3'-Überhänge)

Flexibles Protokoll
Einige Restriktionsenzyme verbieten oder reduzieren den Dephosphorylierungsvorgang, wenn Verdauung und Dephosphorylierung gleichzeitig durchgeführt werden. Daher kann Anza alkalische Phosphatase je nach verwendetem Restriktionsenzym auf eine von drei Arten verwendet werden:

• Ein-Schritt-Protokoll: Gleichzeitiger Restriktionsenzymverdau und Dephosphorylierung im Anza Puffer
• Zwei-Schritte-Protokoll für Hitzeinaktivierung: Die Verdauung wird zuerst durchgeführt, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung (20 Minuten bei 80°C) und einer Dephosphorylierung
• Zwei-Schritte-Protokoll für Säulenaufreinigung: Die Verdauung erfolgt zuerst, gefolgt von der Säulenaufreinigung und der Dephosphorylierung

Keine Enzymentfernung erforderlich
Anza alkalische Phosphatase ist nach 5 Minuten bei 80 °C vollständig inaktiviert, sodass eine Enzymentfernung über Phenol/Chloroform-Extraktion oder Säulenaufreinigung nicht erforderlich ist. Wenn das Ein-Schritt-Protokoll verwendet wurde, das Reaktionsgemisch 20 Minuten lang bei 80°C erhitzen, um das Restriktionsenzym sowie die alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Die Hitzeinaktivierung der alkalischen Phosphatase verhindert, dass die Restphosphatase die DNA-Fragmente, die dem Reaktionsgemisch für die Ligation hinzugefügt wurden, dephosphoryliert.

Anza™ alkalische Phosphatase ist Teil des Anza™ Klonierungssystems mit Restriktionsenzymen, das die herkömmlichen Klonierungsprozesse vereinheitlicht. Weitere Anza DNA-modifizierende Enzyme sind der Anza T4 DNA Ligase Master Mix, das Anza T4 PNK Kit, das Anza DNA Blunt End Kit und das Anza DNA End Repair-Kit.

Weitere Informationen zum Anza System finden Sie unter www.thermofisher.com/anza