Expressway™ Maxi Cell-Free E. coli Expression System
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Expressway™ Maxi Cell-Free E. coli Expression System

Das Expressway™ Maxi Cell-Free E. coli Expressionssystem verwendet eine effiziente, gekoppelte Transkriptions-/Translationsreaktion, um in 4 bis 6 Stunden lösliche, funktionellWeitere Informationen
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Das Expressway™ Maxi Cell-Free E. coli Expressionssystem verwendet eine effiziente, gekoppelte Transkriptions-/Translationsreaktion, um in 4 bis 6 Stunden lösliche, funktionell aktive Milligrammmengen an Protein zu produzieren. Das Verfahren kann in einem Reaktionsröhrchen durchgeführt werden und ist einfach skalierbar, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Die TOPO TA Cloning™ Expressionsvektoren (fünfminütige Klonierung mit 95 % Effizienz) für optimale Expressionsergebnisse sind enthalten. Zusätzlich zu allen Vorteilen eines offenen Expressionssystems bietet die Expressway™ Maxi Technologie ein Mittel zur Herstellung eines hohen Gehalts an rekombinantem Protein, das für verschiedene nachgelagerte Anwendungen leicht erkannt und aufgereinigt werden kann.

Proteinproduktion in Milligrammmengen von 4 bis 6 Stunden
Der Schlüssel zur Expressway™ Maxi Technologie ist die einzigartige Formulierung des Zufuhrpuffers, der die Reaktionsproduktivität steigert, so dass mehr als ein Milligramm Protein in einer 2 ml-Reaktion innerhalb von 4 bis 6 Stunden produziert wird (Abb. 1). Die Formulierung des Lysat ermöglicht die Proteinsynthese mit Hilfe von zirkularen oder linearen Templates.

Hochdurchsatzkompatibel (HTP)
Dieses System ist auch für HTP-Expression ausgelegt. Ein Kit reicht für 200 x 50 Reaktionen, die mit 2 x 96-Well Platten ausgeführt werden können. Ohne Zufuhrpuffer benötigen solche Reaktionen nur zwei Stunden. Sobald eine positive Expression erkannt wurde, kann die Scale-up-Proteinproduktion mit dem großen, zellfreien Expressway™ Format oder in E. coli-zellbasierten Systemen durchgeführt werden.

Optimierte Vektoren
pEXP5 TOPO™ TA-Vektoren sind für die Verwendung im Expressway™ Milligrammsystem optimiert (Abb. 2). Diese Vektoren sollen zusätzliche Aminosäurensequenzen minimieren, die die native Proteinfaltung und -funktionalität beeinträchtigen können. Zu den Merkmalen dieser Vektoren gehören:

• Der pEXP5-NT/TOPO™ Expressionsvektor liefert N-terminale Histidin-Tags und eine TEV-Protease-Erkennungsstelle

• Der pEXP5-CT/TOPO™ Expressionsvektor kann zur Expression von Proteinen mit einem C-terminalen Histidin-Tag oder für die native Proteinexpression verwendet werden, indem ein Stoppkodon am Ende Ihres Gens von Interesse eingeführt wird

Einfaches und schnelles Verfahren
Das Expressway™ Maxi Cell-Free Expressionssystem verfügt über alle Komponenten, die für eine optimale zellfreie Proteinproduktion benötigt werden. Das System beinhaltet einen E. coli-Extrakt, IVPS-Reaktionspuffer, Zufuhrpuffer, T7-Enzymgemisch, 19-Aminosäurengemisch und einzelne Röhrchen mit Methionin. Um eine 2 ml-Reaktion zu starten, mischen Sie den Reaktionspuffer, den 19-Aminosäurengemisch, je nach Wahl markiertes oder nicht markiertes Methionin und Cystein, T7-Enzymgemisch und Ihr DNA-Template (mit T7-Promotor) mit dem E. coli-Extrakt. Fügen Sie nach einer 30-minütigen Inkubation den Zufuhrpuffer hinzu. Die Milligramm-Konzentrationen an aktivem Protein werden innerhalb von 4 bis 6 Stunden synthetisiert. Um eine HTP-Expression durchzuführen, mischen Sie einfach alle Komponenten und Aliquoten in ein HTP-Format.
Nur für Forschungszwecke. Darf nicht für diagnostische Verfahren eingesetzt werden.
Specifications
Exprimierter Protein-TypWasserlösliches Protein
ExpressionsmechanismusZellfreie Expression
ExpressionssystemZellfrei
ProdukttypZellfreies Expressionssystem
Menge1 kit
VektorpEXP5-NT/TOPO, pEXP5-CT/TOPO
KlonierungsmethodeTopo™-TA
ProduktlinieExpressway™
PromoterT7
ProteinmarkierungN-Terminus
Unit SizeEach
Inhalt und Lagerung
Das Expressway™ Maxi Cell-Free Expressionssystem ist je nach Anforderungen für zweihundert 25 µl-Reaktionen, fünf 1 ml-Reaktionen oder eine 5 ml-Reaktion (Anfangsvolumen) oder eine bis mehrere große Reaktionen ausgelegt. Das System enthält das E.coli slyD-Extrakt, 2,5x IVPS-Reaktionspuffer, Zufuhrpuffer, 19-Aminosäurengemisch, Methionin, DNase/RNase-freies Wasser, T7-Enzymgemisch und einen positiven Expressionskontrollvektor. Das Expressway™ Maxi Cell-Free E. coli Expressionssystem mit pEXP5-NT/TOPO™ und pEXP5-CT/TOPO™ enthält außerdem die pEXP5-NT/TOPO™ und pEXP5-CT/TOPO™ TA-Expressionskits. Jedes Kit enthält den pEXP5-NT/TOPO™ oder pEXP5-CT/TOPO™ Vektor, weitere Reagenzien zur Vereinfachung der TOPO™ Klonierung und One Shot™ TOP10 Chemisch kompetentes E. coli. Lagerung der Vektoren bei -20 °C. Alle anderen Komponenten bei -80 °C lagern. Bei ordnungsgemäßer Lagerung garantiert 6 Monate stabil.

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

I accidentally stored my E. coli slyD-Extract, E. coli Reaction Buffer (-A.A.), and 2X feed buffer at room temperature. Can I still use them?

Unfortunately, this may result in a loss of activity.

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I've run out of the T7 RNA polymerase for my cell-free expression. What do you suggest I use?

We would recommend using T7 RNA polymerase (Cat. No. 18033019, 50 U/µL). Use 1-1.5 µL in a 50 µL reaction system.

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I'm getting smearing after running my cell-free expression reaction on a gel.. What could be the cause of this?

Smearing may occur if samples for the following reasons:

- Samples were not precipitated with acetone: precipitate proteins with acetone to remove background smearing.
- Too much protein was loaded: reduce the amount used.
- The gel itself was not clean: rinse the gel briefly before exposing to film.
- Ethanol was present in the protein synthesis reaction: make sure that any residual ethanol is removed during DNA purification.
- Check the date of your pre-cast gels: do not use gels after the expiration date.

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I'm seeing a ladder of small-sized products after running my reaction on a gel when using the Expressway system. Why is this?

There may be several reasons for why this is occurring. The most common are: proteolysis, degradation of DNA and/or RNA templates (truncated templates will generate truncated protein products), internal initiation (if there are many methionines and internal RBS-like sequences in the gene, the ribosome may initiate translation from the wrong methionine), premature termination, translational pausing, frequent rare codon usage, complicated secondary structure of RNA, and others. This can also happen if proteins are denatured for too long, or not enough SDS was added to the 1X SDS-PAGE sample buffer.

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With a cell-free expression system, I'm getting good protein yield, but it has low biological activity. What can I do?

- Your protein may not be folding properly: try to reduce the incubation temperature to as low as 25 degrees C during synthesis.
- You may require post-translational modification of your protein: the Expressway system will not introduce post-translational modifications to the recombinant protein.
- Your synthetic protein may require co-factors for complete activity: try adding required co-factors to the protein synthesis reaction.

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