El sistema de ensamble genético GeneArt® High-Order es un kit muy eficaz para un perfecto ensamble simultáneo de hasta 10 fragmentos de ADN, con un total de hasta 110 Kbp de longitud, en cualquier vector. El sistema depende de la capacidad de las levaduras para tomar y recombinar fragmentos de ADN con alta eficiencia. Esto reduce en gran medida la manipulación in vitro del ADN y elimina la necesidad de tratamientos enzimáticos, como la restricción y la ligadura, al tiempo que permite realizar fusiones precisas de secuencias de ADN. El kit contiene materiales para la transformación y purificación a partir de levaduras, incluidos los medios selectivos de levaduras y E. coli competente para la amplificación plasmídica de clones correctos.

• Fácil y potente: clone hasta 10 fragmentos de ADN, con la secuencia de su elección, de forma simultánea en un solo vector (hasta 110 Kbp); no requiere digestión de restricción, ligadura o sitios de recombinación
• Precisión y eficacia: diseñada para permitirle clonar lo que usted desee, donde usted desee, en la orientación que desee, y lograr hasta un 90 % de clones correctos sin dejar secuencias adicionales
• Flexibilidad: utilice nuestro vector lineal, un vector de su elección o clone fragmentos de ADN preexistentes sin homología final sin más modificaciones
• Herramientas gratuitas: diseñe oligonucleótidos de ADN y más con nuestra interfaz basada en la web que le guiará paso a paso en su proyecto
• Diversas aplicaciones: optimice muchas técnicas de biología sintética y biología molecular con la rápida combinación, adición, eliminación o intercambio de segmentos de ADN

Para la clonación de 1 a 4 fragmentos de ADN de tamaño limitado y, si prefiere, un enfoque in vitro, considere el uso del kit de clonación y ensamble GeneArt® Seamless (n.º de referencia A13288).

Cree fácilmente nuevas construcciones específicas a partir de diversos fragmentos de ADN
El sistema de ensamble genético GeneArt® High-Order aprovecha la recombinación asociada a la transformación (TAR) en la levadura Saccharomyces cerevisae para unir fragmentos de ADN preexistentes u oligonucleótidos químicamente sintetizados en una sola molécula recombinante. Los fragmentos de ADN y el vector linealizado se unen en base a la homología de terminaciones compartida. Si no existe tal homología de terminaciones entre piezas, estas pueden «coserse» junto con los linadores de recombinación, oligonucleótidos sintéticos de ADN que proporcionan homología de terminaciones entre dos fragmentos de ADN no relacionados. El proceso es muy eficiente, no plantea problemas y no deja secuencias adicionales después del ensamblaje. Aunque se ha demostrado que funciona hasta 0,5 Mb y 50 fragmentos de ADN, este producto se ha optimizado para hasta 110 Kb y 10 fragmentos de ADN en un vector.

Verificación simple de clones
Para minimizar el trabajo que se realiza en levaduras, los clones recombinantes de levaduras se someten a un protocolo simplificado de extracción de ADN de 10 minutos. La extracción produce moléculas ensambladas en cantidad suficiente para realizar la verificación PCR de colonias de las uniones, así como la transformación directa de células de E. coli para un análisis posterior. El kit incluye el tampón de lisis patentado y los gránulos de vidrio necesarios para la extracción.

Consideraciones a la hora de elegir un vector de clonación
El sistema de ensamble genético GeneArt® High-Order requiere vectores de transporte con una gran capacidad y que sean compatibles con levaduras y E. coli (es decir, vectores de transporte BAC-YAC). Este producto no incluye vector de clonación, pero ofrecemos un vector de clonación lineal listo para usar por separado llamado Vector pYES1L GeneArt® con Sapphire Technology™ (n.º de referencia A13287). También puede utilizar su propio vector, pero debe ser compatible con el sistema de ensamblaje genético High-Order. Esta compatibilidad se puede lograr fácilmente con el casete de conversión de vectores GeneArt® High-Order (n.º de referencia A13291).

Eficacia de la clonación
En el ensamblaje GeneArt® High-Order los principales factores que influyen en la eficiencia de la clonación son el tamaño de los elementos de ADN, la cantidad de ellos que no tienen homología de terminaciones, el tamaño total de la molécula final y la calidad y especificidad del fragmento. El extremo terminal de los fragmentos de PCR (salientes A o romos) no afecta a la eficacia de la clonación.

La eficacia típica de clonación para diferentes cantidades de fragmentos con homología terminal ensamblada en el vector pYES1L GeneArt® con Sapphire Technology™ son las siguientes:
• >90 % para cinco fragmentos de ADN de 10 Kb cada uno
• >90 % para 10 fragmentos de ADN de 5 Kb cada uno
• >50 % para 10 fragmentos de ADN de 10 Kb cada uno

Eficiencias comunes de clonación para fragmentos preexistentes, sin homología de terminaciones, ensambladas en el vector GeneArt® pYES1L con Sapphire Technology™ mediante el uso de oligonucleótidos de ADN que se utilizan:
• >90 % para un fragmento de 10 Kb
• >75 % para dos fragmentos de ADN de 10 Kb cada uno

Diseñe su clonación en sílice
Un paso clave en el ensamblaje GeneArt® High-Order es el diseño correcto de fragmentos y oligos con la homología y el espaciado adecuados para garantizar el ensamblaje perfecto del clon. Con el fin de simplificar y acelerar el proceso de diseño, proporcionamos una herramienta gratuita en línea para ayudarle a diseñar su experimento en sílice. La herramienta comprueba la compatibilidad del diseño experimental con las especificaciones del producto, diseña oligonucleótidos de ADN para la amplificación de PCR o para la unión de los diferentes elementos que se van a clonar y presenta al usuario una representación gráfica del vector así como una secuencia anotada descargable en formato GenBank, compatible con el software Vector NTI®.

Aplicaciones
El sistema de ensamblaje genético GeneArt® High-Order está diseñado para potenciar los experimentos de clonación y ensamblaje de ADN en una amplia gama de aplicaciones de biología molecular y biología sintética, entre otras. El producto permite la creación de vectores de expresión modulares, con piezas intercambiables, y se puede utilizar para realizar una variedad de tareas que de otro modo requerirían múltiples pasos. Use el kit simplemente para construir proteínas de fusión, eliminar, reemplazar o agregar elementos de ADN como sitios de restricción, clonar grandes fragmentos de ADN preexistentes sin homología de terminaciones y muchas otras técnicas que requieren la manipulación de secuencias genéticas.