Le kit de détection et d’extraction de Arf1 active Thermo Scientific Pierce est un kit complet pour l’enrichissement sélectif et la détection de la GTPase Arf1 liée à la GTP par une interaction protéique spécifique avec le domaine de liaison aux protéines de la GGA3.

Le kit de détection et d’extraction de Arf1 active comprend le domaine de liaison protéique (PBD) purifié à GST-GGA3, la résine d’agarose de glutathion, les contrôles positifs et négatifs (GTPγS et GDP, respectivement), le tampon de lyse / liaison / lavage, l’anticorps primaire anti-Arf1, le tampon d’échantillon, les colonnes de centrifugation et les tubes de prélèvement. Le kit a été validé à l’aide de lysats provenant de cellules MDCK, une lignée cellulaire dont l’activité Arf1 est robuste.

Caractéristiques du kit de détection et d’extraction de Arf1 active :

• Hautement sensible et précis — des réactifs optimisés, un anticorps anti-Arf1 spécifique et une procédure de transfert Western garantissent des contrôles précis et des résultats semi-quantitatifs
• Validé — testé fonctionnellement pour la détection de Arf1 afin de garantir la qualité et la performance
• Compatible — efficace pour une variété de types de cellules provenant de la souris, du rat et de l’homme

Applications :
• Suivez l’activation de la GTPase Arf1 pendant la différenciation, la migration, la division et le réarrangement du cytosquelette des cellules
• Étudiez l’activation d’Arf1 pendant l’assemblage des protéines d’enveloppe sur les vésicules bourgeonnantes ou le réseau trans-golgi et les endosomes
• Surveillez l’activité de Arf1 après stimulation avec des facteurs de croissance
• Surveillez l’activité de l’Arf1 après traitement par un inhibiteur de petite molécule

Le kit de détection et d’extraction de Arf1 active a été validé pour la fonction et la spécificité de la méthode d’enrichissement de Arf1 active à l’aide de lysats cellulaires traités avec GTPγS pour activer la Arf1 endogène et comparés aux lysats traités à la GDP pour inactiver la petite GTPase. Le traitement GTPγS piège la Arf1 sous forme liée à la GTP (active), ce qui entraîne un signal fort lorsque la Arf1 endogène est présente. Le traitement GDP fait passer la Arf1 à l’état GDP-lié (inactive), ce qui n’entraîne que peu ou pas de signal, quels que soient les niveaux de protéines Arf1. Le kit est optimisé pour la détection du transfert Western à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué au HRP (anti-IgG de lapin de chèvre, réf. n° 31460) et du substrat chimiluminescent Thermo Scientific SuperSignal West Pico (réf. n° 34080). Le kit contient des composants en quantité suffisante pour 30 dosages d’extraction.

Fond Arf1 :
Les protéines 1 à 6 du facteur de ribosylation ADP (Arf) sont des membres de la famille Ras des petites GTPases. Bien que structurellement similaires, les rôles cellulaires des Arf1 à 6 sont différents de ceux des autres membres de la famille Arf ; leurs rôles endogènes ne sont pas la ribosylation de l’ADP, mais plutôt la régulation des protéines G hétérotrimériques. Les protéines Arf peuvent être divisées en trois classes : Classe I : Arf 1 à 3 ; classe II : Arf 4 et 5 ; classe III : Arf6. Les ARF de classe I et II sont associées au réseau trans-Golgi (TGN) et participent au recrutement de protéines effectrices dans la membrane de Golgi et à la formation de vésicules. Contrairement aux autres GTPases, les GTPases Arf sont modifiées par myristoylation à l’extrémité amino-terminale pour permettre l’insertion dans la membrane. La protéine de classe III Arf6 est associée à la membrane plasmique et est impliquée dans la formation de vésicules au niveau de la membrane plasmique, le recyclage des vésicules et le remodelage du cytosquelette d’actine.

Bien que les GTPases Arf soient exprimées dans toutes les cellules, Arf1 est la plus abondante, la plus active et la mieux caractérisée. L’ARF1 recrute ses effecteurs, y compris le complexe adaptateur de coatomère et de clathrine (AP), au Golgi pour la formation et le bourgeonnement de vésicules. Après le recrutement, Arf1 maintient les protéines d’enveloppe sur la membrane jusqu’à ce que la vésicule se forme. L’Arf1 interagit ensuite avec son effecteur, ce qui entraîne la libération de l’Arf1 de la membrane et le bourgeonnement de la vésicule. Les protéines de liaison de l’effecteur Arf de l’oreille γ à localisation golgienne (GGA) contiennent un domaine VHS amino-terminal, un domaine d’homologie à GGA (GGAH), une région de liaison riche en proline et un domaine d’homologie à l’adaptine à l’oreille γ à l’extrémité carboxylique (AGEH). Le domaine VHS interagit avec les domaines cytoplasmiques pour le tri des récepteurs, le domaine GGAH se lie à la Arf activée, la région riche en proline interagit avec la clathrine et le domaine AGEH interagit avec les protéines cytosoliques. Grâce à des études mutationnelles, le domaine GGAH s’est révélé être suffisant pour lier la Arf liée au GTP, tandis que la Arf1 lie les trois protéines effectrices GGA. L’association des protéines GGA avec le TGN et la membrane plasmique est régulée par la Arf.

Plus de données sur les produits
• Mesure de l’activation de petits GTPases par l’intermédiaire de leurs effecteurs en aval spécifiques