Le réactif de transfert de marquage à la biotine sulfo-SBED Thermo Scientific Pierce est un réactif multifonctionnel pour marquer une protéine purifiée, puis transférer de manière covalente le tag biotine attaché sur des partenaires d’interaction spécifiques à cette protéine.

Sulfo-SBED est l’abréviation de sulfo-N-hydroxysuccinimidyl-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido) éthyl-1,3'-dithioproprionate. Il s’agit d’un agent de réticulation chimique hétérobifonctionnel capable de se lier de manière covalente aux amines primaires à une extrémité et à presque tous les groupes fonctionnels présents dans les protéines à l’autre extrémité. Contrairement aux agents de réticulation classiques, le sulfo-SBED comprend également un groupe biotine et un bras espaceur disulfure clivable. Ensemble, ces caractéristiques permettent une réticulation séquentielle des protéines en interaction et le transfert du tag d’affinité biotine d’une protéine (c.-à-d. une protéine “appât” purifiée) sur une autre protéine (peut-être une protéine “proie” inconnue). Le transfert de marquage est une méthode in vitro puissante pour la découverte d’interactions entre protéines. Un nombre croissant de publications comprennent l’utilisation du réactif de transfert de marquage à la biotine sulfo-SBED pour identifier des interactions avec des partenaires de liaison protéique inconnus jusqu’ici et pour mieux caractériser les domaines de liaison protéique spécifiques dans d’autres interactions entre protéines.

Protocole type pour une expérience de transfert de marquage :

• Ajoutez quelques microlitres de réactif sulfo-SBED dissous avec 0,5 à 1 ml de protéine appât purifiée dans du PBS.
• Incuber le mélange dans l’obscurité, sur la glace ou à température ambiante, pendant 30 à 120 minutes.
• Dessalez ou dialysez (avec un éclairage tamisé) pour séparer le surplus de sulfo-SBED n’ayant pas réagi de la protéine “appât” marquée.
• Ajoutez la protéine appât marquée au lysat cellulaire ou à toute autre solution contenant de potentielles protéines cibles de liaison (“proie”).
• Lorsque des complexes d’interaction se sont formés, exposez la solution à une lumière ultraviolette (365 nm) pendant plusieurs minutes.
• Analysez les produits à l’aide de l’une des méthodes suivantes :
• Transfert Western : Clivez les produits de réticulation dans du DTT, séparez les protéines par SDS-PAGE, et détectez les bandes biotinylées par transfert Western à l’aide de la streptavidine-HRP.
• Purification suivie d’une analyse par spectrométrie de masse ou un séquençage : Purifiez par affinité les protéines biotinylées ou les fragments de peptides après digestion par la trypsine et effectuez la MS ou le séquençage pour caractériser les protéines impliquées.

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