Le kit de clonage par PCR Thermo Scientific CloneJET, également disponible avec les cellules DH10B (K123120), est un système perfectionné de sélection positive pour un clonage extrêmement efficace de produits PCR générés avec tout ADN polymérase thermostable. Tout autre fragment d’ADN à extrémités franches ou adhérentes peut être cloné. Il est idéal pour les fragments d’ADN phosphorylés ou non phosphorylés. La ligature dans le vecteur de sélection positive inclus ne prend que 5 minutes, et son rendement est de plus de 99 % de clones recombinants. Les produits PCR à extrémités franches générés avec une enzyme corrective sont ligaturés directement dans le vecteur de clonage.

Les produits PCR générés soit avec des ADN polymérases sans activité corrective soit avec des mélanges d’ADN polymérases sont débarrassés des extrémités avant la ligature en 5 minutes grâce à l’enzyme de coupe franche d’ADN thermostable, fournie avec le kit. Toutes les souches courantes d’E. coli de laboratoire peuvent être directement transformées avec le produit de ligature.

Caractéristiques

Le kit de clonage par PCR CloneJET comporte un vecteur de clonage à sélection positive innovant et prêt à l’emploi pJET1,2 / blunt. Le vecteur contient un gène d’enzyme de restriction létale qui est perturbé par ligature d’un insert d’ADN dans le site de clonage. Résultat : seules les cellules bactériennes avec plasmides recombinants sont capables de former des colonies. Les molécules recircularisées du vecteur pJET1,2 / blunt auxquelles il manque un insert expriment une enzyme de restriction létale qui tue la cellule E. coli hôte après transformation. La sélection positive accélère radicalement le processus d’analyse de la colonie et élimine les frais supplémentaires nécessaires à la sélection blanc / bleu.

Pour faciliter la représentation et la manipulation de l’insert, le site de clonage multiple du vecteur de clonage pJET1,2 / blunt comporte deux séquences de reconnaissance BglII qui flanquent le site d’insertion. En outre, le vecteur contient un promoteur T7 pour la transcription in vitro et in vivo ainsi que pour le séquençage de l’insert.

Points clés

• Rapidité : clonage par PCR en à peine 5 minutes
• Efficacité maximale : > 99 % de clones positifs
• Pas de bruit de fond de clonage—vecteur à sélection positive
• Polyvalent : convient parfaitement au clonage d’extrémités tronquées ou cohésives
• Économique : pas de sélection blanc / bleu coûteuse

Applications

• Clonage de produits issus de la PCR à extrémités franches ou à queue 3’-dA jusqu’à 10 kb
• Clonage de fragments d’ADN générés par enzymes de restriction
• Séquençage d’ADN cloné
• Transcription in vitro et in vivo d’inserts clonés du promoteur T7

Comprend

•Vecteur de clonage pJET1,2 / blunt
• ADN ligase T4
• Tampon de réaction 2X
•Enzyme de coupe franche d’ADN
• pJET1,2Amorce sens de séquençage (5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’)
• pJET1,2 Amorce antisens de séquençage (5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’)
• Produit de PCR de contrôle
• Eau exempte de nucléase
• Protocole détaillé

Avant l’électroporation, purifiez toujours à l’aide d’une colonne le mélange de ligature en utilisant par exemple le kit de purification GeneJET PCR #K0701 ou du chloroforme pour l’extraire. L’électroporation est inhibée par la présence de protéines et de sels dans le mélange.

Produits associés
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