제품 설명:
Sequenase™ Version 2.0 DNA Polymerase는 T7 DNA 중합효소가 유전자 변형된 형태입니다. 야생형 효소와 달리 이 물질은 거의 3'→5' 엑소뉴클레아제 작용이 없습니다. Sequenase Version 2.0은 연작용 특성이 강하고 뉴클레오티드 아날로그(dlTP, 티오-dNTP, 디데옥시-NTP 등)와 결합하며 2차 구조에 의해 억제되지 않고 가닥 변위 합성을 수행할 수 있습니다. 이 물질은 디디옥시-염기서열분석에 매우 효과적인 효소이며 특히 연관된 엑소뉴클레아제의 비활성화가 필요한 다른 애플리케이션에서도 유용합니다.

Sequenase Version 2.0은 두 개의 소단위가 있는데 하나는 E. coli 단백질 티오레독신(MW 12,000)이고 다른 하나는 박테리오파지 T7 유전자 5 단백질이 유전자 변형된 버전입니다(MW 76,000). 이 소단위의 유전적 변화(체외 돌연변이 유도에 의한 28 아미노산의 제거)는 DNA 중합효소 작용의 변화 없이 모든 측정 가능한 엑소뉴클레아제 작용을 제거합니다.

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특성:
분자량: 두 개의 소단위, 수정된 T7 유전자 5 단백질(76kDa) 및 E. coli
티오레독신(12 kDa)으로 구성
최적 pH: 7.5
최적 온도: 37°C
2가 양이온 요건: Mg2⁺, Mn2⁺

순도:
SDS-PAGE에 의해 결정된 95%보다 높은 순도. 엔도뉴클레아제, 이중 가닥 및 단일 가닥 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 오염에 대한 테스트 완료.

저장 완충액:
20mM 인산칼륨(pH 7.4), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% 글리세롤.

분석 조건:
반응 혼합물(100μL)에는 40mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 5mM DTT, 0.3mM dNTP, 5pmol M13 범용 프라이머에 사전 어닐링한 5μg M13mp18 등이 포함됩니다. 미리 따뜻하게 만든(37°C) 반응 혼합물에 효소를 추가합니다. 배양은 37°C에서 1분간 진행합니다.

단위 정의:
효소의 한 단위는 37°C에서 30초 안에 1nmol의 뉴클레오티드를 산성의 불용성 형태로 결합하는 것을 촉진합니다.

농도:
13단위/μL

기능 테스트:
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(PN 70770)를 사용한 DNA 염기서열분석.

기능 테스트가 완료된 5X Sequenase Reaction Buffer(1ml 포함, PN 70702):
200mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM MgCl₂, 250mM NaCl

Sequenase Dilution Buffer(1ml 포함, PN 70765):
10mM Tris-HCl(pH 7.5), 5mM DTT, 0.1mM EDTA.

참고 문헌:
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 6447-6458.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, P. C., Boushey, H. A., Ganem, D. and DeRisi, J. L. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15687-15692.
Paris, M. (1992) Comments 18, (No. 3), United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) Proc.Natl. Acad Sci. USA 84, 4767-4771.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080.