Alexa Fluor™ dye의 NHS esters (succinimidyl esters라고도 함)는 단백질의 일차 아민(R-NH2), 아민 변형 올리고뉴클레오티드, 기타 아민 함유 분자에 형광 표지를 추가하는 데 사용할 수 있는 반응성 분자입니다. 그렇게 얻어진 Alexa Fluor™ conjugate는 분광학적으로 유사한 형광 conjugate보다 밝은 형광과 우수한 광안정성을 제공합니다. Alexa Fluor™ 680 NHS ester는 Cy5.5와 분광학적으로 유사한 conjugate(여기/방출 = 684/707 nm)를 제공합니다.

Alexa Fluor™ dye는 가시광선 및 근적외선에 걸친 형광 여기에 사용할 수 있으며(Molecular Probes™ Handbook의 The Alexa Fluor™ Dye Series—Note 1.1 참조) 다양한 생물학적 환경에서 이용할 수 있도록 pH 4∼10 범위의 pH 불감성과 수용성의 고유한 조합을 제공합니다.

전형적인 Conjugation 반응
프로토콜이 lgG 항체에 최적화되어 있어 실제적으로 모든 단백질 또는 펩티드에 아민 반응성 reagent를 접합시킬 수 있습니다. 어떠한 양의 단백질에서든 반응을 확장할 수 있으나 최적의 반응을 위해 단백질 농도는 2 mg/mL 이상이어야 합니다. 반응 reagent와 단백질 몰 비율을 3가지로 하여 3가지 표지를 시도하도록 권고합니다.

Alexa Fluor™ NHS ester는 대개 우수한 품질의 anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO) (D12345)에서 용해되며 이 반응은 0.1–0.2 M sodium bicarbonate buffer, pH 8.3, 실온에서 1시간 동안 이루어집니다. 최종 아민의 pKa가 lysine epsilon-amino group 보다 낮기 때문에 중성 pH와 가까운 buffer를 이용해 아민 말단에 보다 선택적으로 표지할 수 있습니다.

Conjugate 정제
Sephadex™ G-25, BioGel™ P-30 등의 겔 여과 컬럼을 사용해 표지된 항체가 free Alexa Fluor™ dye에서 분리됩니다. 보다 크거나 작은 단백질의 경우, 적절한 분자량 절단값을 갖는 겔 여과 배지를 선택하거나 투석법으로 정제합니다.

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