BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP는 기존 RNAi vector의 장점(안정적인 발현과 바이러스 전달 사용 능력)과 동일한 transcript에서 조직 특이적 발현 및 다중 표적 knockdown 능력을 결합하였습니다. BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP에 들어있는 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR vector는 표적 sequence와 100% 동일하게 만들어진 인공 miRNA를 발현하도록 만들어져 표적을 절단하여 발현을 엑제합니다. 이 vector에는 긴 Pol II transcript(pre-miRNA)에서 내재성(endogenouse) miRNA를 생성하는 flanking 및 loop sequence가 포함됩니다. 수상 경력이 있는 Invitrogen의 BLOCK-iT™ RNAi Designer를 사용하여 디자인되며 디자인된 염기서열의 70 % 이상이 70% 이상의 knockdown을 생성합니다. 조작된 miRNA의 Pol II 발현은 다음을 가능하게 합니다.
o MultiSite Gateway™ 발현을 통한 CMV immediate early promoter에서 강한 발현, 조직 특이적 또는 기타 조절된 promoter 사용 옵션
o pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR vector에서 Emerald GFP (EmGFP) reporter의 co-cistronic 발현으로 EmGFP 발현과 miRNA의 knockdown 활성의 강력한 상관 관계를 보여주게 됩니다.
o 유전자 발현에 Invitrogen의 여러 Gateway™ destination (DEST) vector 사용 가능, 분할(dividing) 및 비분할(non dividing) 및 초대 배양 세포 유형의 안정적인 tranduction을 위한 Lentiviral vector, 단일 부위 염색체 삽입을 위한 Flp-In™ system, 다른 reporter 유전자 발현 시스템등과 사용가능
o 동일한 transcript에서 조작된 하나 이상의 miRNA가 발현하여 여러 유전자의 동시 knockdown과 합성 표현형 생성이 가능합니다.
작동 방식
높은 수준의 miR RNAi sequence 발현을 위해 pcDNA™6.2-GW/miR vector에 CMV promoter가 들어있습니다(그림 1).간단히 RefSeq accession number 또는 nucleotide sequence를 무료 온라인 BLOCK-iT™ RNAi Designer에 입력하면 소프트웨어가 관심 유전자와 100% 동일한 최적화된 miRNA를 설계합니다. 빠른 ligation 프로토콜을 사용해 miRNA를 vector에 복제하여 즉각적인 miRNA 발현을 위해 transfection합니다. 발현된 miRNA는 핵 내 내인성 세포 기전으로 처리되고(Drosha 포함) 세포질로 transport되어 Dicer로 추가 처리됩니다(그림 2). 이렇게 완전히 처리된 miRNA가 RISC에 통합되어 siRNA 같은 기능을 하고 mRNA 표적을 절단합니다.
다양한 발현 옵션을 위해 EmGFP, miR flanking 부위, 관심 표적 miRNA 동종물을 포함한 miRNA 카세트를 쉽게 DEST vector로 이동할 수 있습니다. 이는 miRNA 카세트가 pDONR™ vector로 이동하고(BP reaction) 다시 선택한 DEST vector로 넣어지는(LR reaction) Gateway™ 재조합 반응을 통해 쉽게 이동할 수 있습니다.