El kit de precipitación «pull-down» y destiobiotinilización EZ-Link Thermo Scientific es un conjunto completo de reactivos para etiquetar proteínas purificadas con biotina y utilizarlas para purificar complejos de interacción utilizando resina de agarosa de estreptavidina con condiciones de elución suaves.

Características del kit de precipitación «pull-down» y destiobiotinilización EZ-Link:

• Sulfo-NHS-LC-destiobiotina: etiquete las proteínas con una biotina que se une específicamente a la estreptavidina pero que también se eluye fácilmente en condiciones leves
• Ensayo de precipitación «pulldown»: protocolo y reactivos simples y optimizados para marcar proteínas y recuperar (purificar) complejos de interacción de proteínas funcionales intactos
• Kit completo: incluye el etiquetado de reactivos y columnas de desalado para preparar proteínas cebo, así como estreptavidina agarosa y tampón de elución para realizar la precipitación «pull-down»

Este kit de etiquetado y purificación todo en uno utiliza sulfo-NHS-LC-destiobiotina, un éster NHS reactivo con grupos de aminas, para marcar de forma eficaz una muestra de proteína purificada o mixta para utilizarla como cebo en la captura y purificación de interacciones de proteínas. Las etiquetas de destiobiotina de las proteínas etiquetadas se unen a la estreptavidina con alta especificidad, pero se eluyen fácilmente con condiciones muy leves (es decir, por desplazamiento competitivo con la biotina regular y libre). El sistema permite la captura y el aislamiento (precipitación «pulldown») eficaces pero suaves de complejos específicos de la interacción de la proteína de lisados de la célula usando las cuentas de la estreptavidina agarosa. El kit completo incluye viales de 1 mg listos para usar de reactivo de destiobiotinilación, columnas de desalado para procesar proteínas etiquetadas y estreptavidina agarosa de alta capacidad con tampones para realizar varios experimentos de análisis de precipitación «pulldown» a escala de microcentrífuga con facilidad. Identificar nuevas interacciones entre una proteína conocida (cebo) y un elemento diana (presa) no descubierto previamente, o confirmar interacciones entre proteínas de presa y cebo conocidas.

La destiobiotina es un análogo de biotina libre de azufre de un solo anillo que se une a la estreptavidina con una especificidad casi igual pero menos afinidad que la biotina (1/Kd = 10¹¹ vs. 10¹⁵M, respectivamente). En consecuencia, las proteínas de cebo destiobiotiniladas y sus elementos de interacción pueden eludirse fácilmente y específicamente a partir de la resina de afinidad de estreptavidina utilizando condiciones leves basadas en el desplazamiento competitivo con biotina libre. Para experimentos de ensayos de precipitación con muestras biológicas, esta característica de liberación suave de la destiobiotina también ayuda a minimizar la copurificación de moléculas endógenas biotiniladas, que permanecen ligadas a la estreptavidina tras la elución de los complejos proteicos objetivo con biotina libre. El sistema modificado de afinidad de la avidina-biotina también elimina la necesidad de utilizar condiciones de elución severas que podrían desasociar complejos o dañar la proteína o célula objetivo. Las técnicas basadas en la destiobiotina son ideales cuando se utilizan proteínas nativas o recombinantes que no se expresan con una etiqueta de fusión y cuando se aíslan proteínas capturadas en condiciones nativas, como la focalización de células intactas o proteínas de superficie celular.

La sulfo-NHS-LC-destiobiotina es una variante de la biotina que se activa como un éster de sulfo-NHS con un brazo espaciador de cadena larga (LC) para etiquetar covalentemente aminas primarias (-NH2) de proteínas u otras moléculas con grupos de destiobiotina. El formato sin peso (viales resellables de 1 mg) elimina las dificultades asociadas con el pesaje de pequeñas cantidades de reactivo y maximiza la protección del reactivo no utilizado contra la hidrólisis.

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