El kit de biotinilación de ARN de extremo de 3' Thermo Scientific Pierce está optimizado para etiquetar el extremo de 3 de las sondas de ARN para facilitar su uso como sondas u objetivos en la EMSA y otros métodos para estudiar las interacciones proteína-ARN.

Características del kit de biotinilación de ARN de extremo 3’:

• No radioactivo: incorpora una etiqueta de biotina que permite una sensibilidad de detección similar a la radioactividad cuando se utiliza con sistemas de detección quimioluminiscentes
• Rápido: el ARN se puede etiquetar en 0,5-2 horas con un procesamiento mínimo posterior
• Fácil de usar: se incluye ligasa de ARN y tampón de reacción optimizado
• Económico: solo pagará una parte del precio si compra las sondas de ARN biotiniladas sintéticas
• Extremo etiquetado: da lugar a alteraciones mínimas de la estructura secundaria del ARN
• Flexible: sondas de ARN transcrito sintéticas o in vitro que van desde 22 hasta 450 nucleótidos

Este completo kit contiene una cadena de ARN sin etiquetar para utilizarla como control positivo, una sonda de ARN biotinilado estándar, inhibidor de la ARNasa, glucógeno y reactivos que mejoran la ligadura.

El kit de biotinilación de ARN de extremo de 3' utiliza la ligasa de RNA T4 para conjugar un solo análogo de nucleótido al terminal 3' de una cadena de ARN. El exclusivo (bis)fosfato de citidina biotinilado utilizado en este kit permite a la ARN ligasa T4 unir una única etiqueta de biotina en sondas de ARN de diversas estructuras y longitudes secundarias con una eficacia superior al 70 %.

Las reacciones de etiquetado realizadas con el kit de biotinilación de ARN de extremo de 3’ requieren típicamente 50 pmol de ARN y un exceso 20 veces superior de nucleótido biotinilado en una reacción de dos horas a 16 °C. Las sondas de ARN más cortas con estructura secundaria mínima pueden ligarse en 30 minutos a 37 °C (por ejemplo, una plantilla de ARN polimerasa). Las sondas de ARN grandes o estructuralmente complejas (por ejemplo, Let-7 y hTR) requieren tiempos de incubación más largos. La optimización de la eficacia de la biotinilación para las moléculas de ARN complejas se consigue alterando la relación ARN-citidina biotinilada, aumentando el tiempo de incubación o añadiendo DMSO a la reacción de etiquetado para desnaturalizar la estructura del ARN.

Después de la reacción de biotinilación del ARN, el ARN etiquetado se precipita fácilmente para eliminar los subproductos de la reacción. La etiqueta de biotina permite que la sonda de ARN se inmovilice o detecte con estreptavidina para estudiar las interacciones de ARN (es decir, ensayos de cambio de movilidad electroforética de ARN, ensayos de extracción de ARN) o para realizar ensayos de transferencia no radioactiva (es decir, Northern blotting y perfiles de miARN).