LanthaScreen™ ERK2 A375 Cell Line

La cascada de transducción de señales de quinasa MAP (MAPK) se activa mediante factores de crecimiento como EGF, PDGF y HGF. La unión de estos factores a sus respectivos receptores de la superficie celular provoca el inicio de la actividad de la tirosina quinasa del receptor, lo que lleva a la activación fosforilada secuencial de las quinasas posteriores, como Ras, Raf, MEK y Erk1⁄2. La MEK activada fosforila las proteínas Erk2 (Mapk1) en un motivo de Thr-Tyr específico (Thr⁄Tyr 185⁄187). Una serie de mutantes de cinasa constitutivamente activa dentro de la vía de la cinasa MAP se han implicado en la oncogénesis. Uno de estos mutantes es BRAF(V600E), que es el mutante BRAF oncogénico más predominante. La línea celular del melanoma humano A375 expresa endógenamente BRAF(V600E), lo que lleva a la activación constitutiva de la vía de la cinasa MAP y la fosforilación de Erk2 en ausencia de ligandos. LanthaScreenTM Erk2 A375 expresa constitutivamente GFP-Erk2 bajo control de un promotor de CMV. Utilizando esta línea celular, se ha desarrollado un inmunoensayo homogéneo en el que se detecta el estado de fosforilación de Erk2 en lisados celulares con un anticuerpo anti-pTpY-185⁄187-Erk2 marcado con terbio en una lectura de FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET). Esta línea celular puede usarse para evaluar la actividad compuesta en comparación con BRAF(V600E). El lentivirus GFP-Erk2 se ha transducido en células A375, seguido por la selección con blasticidina. Esta línea celular es una población clónica aislada por citometría de flujo utilizando la fluorescencia de GFP como marcador de clasificación. Utilizando el inmunoensayo de TR-FRET lítico, esta línea celular se ha validado para EC50 y Z’ en condiciones optimizadas usando EGF como ligando para la fosforilación de GFP-Erk2. Este ensayo también se ha probado para determinar el rendimiento en condiciones experimentales diversas, incluidos la densidad de las placas celulares, el tiempo de estimulación, la tolerancia a DMSO y el tiempo de lisis⁄equilibrio celular. También se proporciona información adicional sobre el uso de estímulos alternativos y un inhibidor de moléculas pequeñas.