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Pour calculer les résultats de votre expérience PCR en temps réel (qPCR), vous avez le choix entre une analyse quantitative absolue ou relative.
| Analyse quantitative absolue (méthode PCR numérique) | Analyse quantitative absolue (méthode des courbes d’étalonnage) | Analyse quantitative relative | |
|---|---|---|---|
| Présentation | Pour l’analyse quantitative absolue avec PCR numérique, aucun étalon connu n’est nécessaire. La cible d’intérêt peut être directement quantifiée avec précision, car elle est déterminée par le nombre de réplicats de PCR numérique. | Pour l’analyse quantitative absolue avec la méthode des courbes d’étalonnage, vous évaluez la quantité d’éléments inconnus en vous basant sur une quantité connue. Vous créez d’abord une courbe d’étalonnage, puis vous comparez les éléments inconnus avec la courbe d’étalonnage pour extrapoler une valeur. | Dans le cas de l’analyse quantitative relative, vous analysez les changements dans l’expression génétique qui sont apparus dans un échantillon donné par rapport à un autre échantillon de référence (un échantillon de contrôle non traité par exemple). |
| Exemple | Quantifiez les copies d’allèles rares présentes dans des mélanges hétérogènes. Comptez le nombre d’équivalents cellulaires dans l’échantillon en ciblant l’ADN génomique. Déterminez le nombre absolu de copies virales présentes dans un échantillon donné, sans avoir besoin d’un étalon comme référence. | Faites la corrélation entre le nombre de copies virales et un état pathologique. | Mesurez l’expression génétique en réponse à un médicament. Dans cet exemple, vous comparez le niveau d’expression génétique d’un gène d’intérêt particulier dans un échantillon traité chimiquement par rapport au niveau d’expression génétique dans un échantillon non traité. |
La PCR numérique fonctionne en fractionnant un échantillon en de multiples réactions de PCR en temps réel. Certaines portions de ces réactions peuvent contenir la molécule cible (positive), d’autres pas (négative). Suite à une analyse de la PCR, la fraction de réponses négatives permet de générer une réponse absolue permettant d’obtenir le nombre exact de molécules cibles dans l’échantillon, sans avoir besoin de se référer à des étalons ou à des contrôles endogènes.
Figure 1 : La PCR numérique utilise le rapport entre les réactions PCR positives (blanches) et les réactions PCR négatives (noires) pour compter le nombre de molécules cibles.
La méthode des courbes d’étalonnage pour l’analyse quantitative absolue est similaire à la méthode des courbes d’étalonnage pour l’analyse quantitative relative, à la différence près que les quantités absolues des étalons doivent d’abord être connues par d’autres moyens.
Figure 2 : Tracé de l’amplification et courbe d’étalonnage pour l’analyse quantitative absolue
Recommandations essentielles
Le respect des recommandations ci-dessous est essentiel pour bien utiliser la méthode des courbes d’étalonnage pour l’analyse quantitative absolue :
- Il est important que l’ADN ou l’ARN proviennent d’une espèce pure et unique. Par exemple, l’ADN plasmide préparé à partir d’E. coli est souvent contaminé par de l’ARN, ce qui augmente la mesure A260 et gonfle le nombre de copies calculé pour le plasmide.
- Un pipetage précis est nécessaire, car les étalons doivent être dilués en suivant plusieurs ordres de grandeur. L’ADN plasmide ou l’ARN transcrit in vitro doit être concentré pour obtenir une mesure exacte de la valeur A260. Cet ADN ou cet ARN concentré doit ensuite être dilué 106 à 1012 fois pour avoir une concentration semblable à celle de la cible dans les échantillons biologiques.
- La stabilité des étalons dilués doit être prise en considération, en particulier pour l’ARN. Divisez les étalons dilués en petits aliquotes, entreposez à –80 °C et décongelez une seule fois avant l’utilisation.
Il n’est généralement pas possible d’utiliser l’ADN comme un étalon pour l’analyse quantitative absolue de l’ARN, car il n’y a pas de contrôle pour vérifier l’efficacité de l’étape de transcription inverse.
Étalons
Les quantités absolues des étalons doivent d’abord être connues par certains moyens indépendants. L’ADN plasmide et l’ARN transcrit in vitro sont couramment utilisés pour préparer des étalons de référence absolue. La concentration est mesurée à A260 et convertie en nombre de copies à l’aide du poids moléculaire de l’ADN ou de l’ARN.
Méthodes de calcul de l’analyse quantitative relative
L’analyse quantitative relative peut être effectuée avec les données obtenues avec tous les instruments de PCR en temps réel. Les méthodes de calcul utilisées pour l’analyse quantitative relative sont :
- Méthode des courbes d’étalonnage
- Méthode par comparaison des Ct
Figure 3 : Analyse quantitative relative
Présentation | ||
| Méthode de PCR numérique | Méthode des courbes d’étalonnage | Méthode par comparaison des Ct |
|---|---|---|
| L’analyse quantitative des acides nucléiques s’appuie sur une théorie, consistant à limiter la dilution de l’échantillon qui s’étend sur de nombreuses réactions de PCR. L’analyse quantitative absolue est déterminée en calculant le nombre de réactions négatives par rapport au nombre total de réactions. Ce type d’analyse est différent des comparaisons Ct et delta Ct et permet à chaque cible dosée d’être quantifiée de façon indépendante sans avoir besoin d’étalons de référence. | Il est facile de préparer des courbes d’étalonnage pour l’analyse quantitative relative, car la quantité est exprimée par rapport à un échantillon de base (appelé un calibrateur), tel qu’un contrôle non traité. Pour tous les échantillons expérimentaux, vous déterminez la quantité cible à partir de la courbe d’étalonnage et vous divisez par la quantité cible du calibrateur. Ainsi, le calibrateur devient l’échantillon 1× et toutes les autres quantités sont exprimées sous la forme d’une différence de n-fois par rapport au calibrateur. | Cette méthode compare la valeur Ct d’un gène cible à l’autre (à l’aide de la formule suivante : 2ΔΔCT), par exemple, un contrôle interne ou un gène de référence (p. ex., le gène domestique), dans un seul échantillon. |
Avantages | ||
| Pas besoin de se fier aux références ou aux étalons. La précision désirée peut être obtenue en augmentant le nombre total de réplicats de PCR. Haute tolérance envers les inhibiteurs. Capable d’analyser des mélanges complexes. Contrairement à la qPCR classique, la PCR numérique permet d’obtenir une réponse linéaire concernant le nombre de copies présentes pour permettre de détecter des variations minimes. | L’exécution des amplifications de la cible et du contrôle endogène dans des tubes séparés et l’utilisation de la méthode d’analyse des courbes d’étalonnage permet de minimiser les besoins en optimisation et en validation. | Vous n’avez pas besoin d’une courbe d’étalonnage et vous pouvez augmenter le débit, car il n’est plus nécessaire d’utiliser des puits pour les échantillons des courbes d’étalonnage. Cela élimine également les erreurs de dilution lors de la création d’échantillons des courbes d’étalonnage. Vous pouvez amplifier la cible et le contrôle endogène dans le même tube, augmenter le débit et réduire les erreurs de pipetage. Lorsque l’ARN sert de matrice, l’amplification dans le même tube permet d’obtenir une certaine normalisation par rapport à des variables, telles que l’intégrité de l’ARN et l’efficacité de la transcription inverse. |
Validation expérimentale | ||
| Résultats de PCR numériques validés avec comparaison en côte à côte avec un échantillon bien caractérisé dont le nombre de copies est connu. | Voir les avantages ci-dessus. | Vous devez procéder à une expérience de validation pour montrer que l’efficacité des amplifications de la cible et du contrôle endogène est approximativement identique. |
Recommandations essentielles | ||
| Il est important d’utiliser autant que possible des plastiques à faible liaison tout au long de la configuration expérimentale. Comme la PCR numérique met l’accent sur le dosage d’une dilution limite, tout échantillon qui se colle à un instrument intermédiaire sera perdu et faussera les résultats. Nous recommandons l’utilisation de tubes de 2,0 ml à faible liaison pour les dilutions et de cônes de pipettes à faible rétention. Il est important de connaître la zone numérique de l’échantillon désiré à tester. Si cette zone est inconnue, consultez le guide de l’utilisateur pour déterminer le nombre de copies d’espèces connues (ADN génomique) ou effectuez une expérience de sélection préliminaire avec des dilutions multiples de combinaison échantillon / dosage pour déterminer la concentration numérique optimale afin de garantir l’obtention de données significatives. L’échantillon ne doit pas être conservé à faible concentration pendant des périodes prolongées, ni exposé à une congélation-décongélation excessive. Il a été démontré que les portoirs n’ont pas autant d’incidence sur la reproductibilité que l’utilisation de plastiques antiadhésifs pour la configuration expérimentale. Une planification soigneuse des dilutions est souhaitée pour minimiser la variabilité due au programme de dilution. | Il est important que la solution de réserve d’ADN ou d’ARN soit diluée avec précision, mais les unités utilisées pour exprimer cette dilution n’ont pas d’importance. Si des dilutions x2 d’une préparation d’ARN total à partir d’une lignée cellulaire de contrôle sont utilisées pour élaborer une courbe d’étalonnage, les unités pourraient être les valeurs de dilution 1, 0,5, 0,25, 0,125 et ainsi de suite. En utilisant la même solution de réserve d’ARN ou d’ADN pour préparer des courbes d’étalonnage pour plusieurs plaques, les quantités relatives déterminées peuvent être comparées entre les plaques. Vous pouvez utiliser une courbe d’étalonnage d’ADN pour l’analyse quantitative relative de l’ARN. Cela suppose que l’efficacité de la transcription inverse de la cible est la même dans tous les échantillons, mais que la valeur exacte de cette efficacité n’a pas besoin d’être connue. Pour l’analyse quantitative normalisée selon un contrôle endogène, les courbes d’étalonnage sont préparées pour la cible et pour le gène de référence endogène. Pour chaque échantillon expérimental, la quantité de cibles et de références endogènes est déterminée à partir de la courbe d’étalonnage appropriée. Ensuite, le nombre total de cibles est divisé par le nombre total de références endogènes pour obtenir une valeur cible normalisée. Encore une fois, l’un des échantillons expérimentaux est le calibrateur ou échantillon 1×. Chacune des valeurs cibles normalisées est divisée par la valeur cible normalisée du calibrateur pour générer les niveaux d’expression relatifs. | Pour que la méthode par comparaison des Ct soit valable, l’efficacité de l’amplification de la cible (votre gène d’intérêt) et l’efficacité de l’amplification de référence (votre contrôle endogène) doivent être pratiquement identiques. |
Contrôle endogène | ||
| La PCR numérique ne s’appuie pas sur la présence de contrôles endogènes pour les mesures de référence. | L’amplification d’un contrôle endogène peut être effectuée afin d’uniformiser la quantité d’ARN ou d’ADN ajoutée à une réaction. Pour l’analyse quantitative de l’expression génétique, les chercheurs ont utilisé la ß-actine, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), l’ARN ribosomique (ARNr) ou d’autres ARN comme contrôle endogène. | |
Étalons | ||
| La PCR numérique utilisant le rapport entre le nombre de réplicats négatifs et le nombre total de réplicats pour déterminer un nombre absolu de molécules, aucun étalon n’est requis. | La quantité d’échantillons étant divisé par la quantité de calibrateurs, l’unité de la courbe d’étalonnage est supprimée. Ainsi, il faut simplement que la dilution relative des étalons soit connue. Pour l’analyse quantitative relative, cela signifie que toute solution de réserve d’ARN ou d’ADN contenant la cible appropriée peut être utilisée pour préparer des étalons. |
Ressources
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.