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Thermo Scientific NanoDrop紫外・可視分光光度計は、A280直接測定、A205直接測定、および比色法のアプリケーションを使用した、タンパク質サンプルの定量をサポートします(下記の表 2を参照)。どのメソッドを使用してNanoDrop紫外・可視分光光度計でタンパク質サンプルを定量するかを決定する際に、いくつかの考慮事項があります。
サンプルは精製タンパク質ですか?精製されたタンパク質サンプルは、280 nm での直接吸光度を使用して正確に測定できます。280 nmでの吸光度は、主にアミノ酸のトリプトファン(Trp)およびチロシン(Tyr)の芳香族環によるものです。タンパク質A280は、迅速かつ簡単であり、試薬や検量線が不要で、サンプル消費量が非常に少ないため、最も普及している定量法です。280 nmでの吸光度(A280)を使用して、Beer-Lambertの式A280 = c * ε * b(ここでεは波長依存性タンパク質の消散係数、bは光路長)によってタンパク質濃度(c)を算出します。純粋タンパク質にはそれぞれ固有の消散係数があります。正確な結果を得るには、正しいタンパク質の消散係数εを入力するか、もっとも近いSample Typeを選択する必要があります。NanoDrop OneのProtein Editor機能を使用すると、特定のタンパク質の消散係数を保存できるため、Sample Typeオプションをカスタマイズできます。
NanoDrop One分光光度計でのタンパク質測定は、濃度に加えて、サンプル中の汚染物質に関する情報も提供します。NanoDrop One Thermo Scientific™ Acclaro™のサンプルインテリジェンステクノロジーは、数学アルゴリズムを使用して、タンパク質サンプル中の核酸を検出し、必要に応じて濃度結果を補正します。A260/A280値を確認することによって、サンプル純度も評価できます。A260/A280値が1を超えている場合、タンパク質サンプル中に核酸のコンタミネーションがあることを示している可能性があります。
細胞抽出物やライセートなどの複合混合物中のタンパク質は、Bradford法、BCA 法、Lowry 法またはThermo Scientific™ Pierce™ 660 nmアッセイなどのタンパク質比色アッセイを使用して測定するのが最適です。これらのアッセイでは、紫外領域で吸光しA280を増加させる細胞成分からの吸光度を避け、タンパク質に特異的な濃度が得られます。各アッセイのバッファー互換性については、製造元の製品資料を参照してください。上記の比色アッセイは、NanoDrop One/OneC およびNanoDrop 8000装置にあらかじめ構成されているアプリケーションです。(表2)
タンパク質/ペプチドにTrp残基およびTyr残基が含まれていますか?タンパク質のペプチド骨格が190~220 nmで光を吸収します。Tyr残基またはTrp残基を欠くペプチド(そのためA280アプリケーションを使用して測定できない)は、205 nmでの吸光度を使用して定量できます。多量のTrpおよびTyrを持つタンパク質もA205アプリケーションを使用して、Scopesメソッドオプションを選択することにより定量できます。タンパク質A205は、NanoDrop One装置ではあらかじめ構成されているアプリケーションですが。
タンパク質は標識されていますか?標識抗体または他の蛍光標識されたタンパク質および金属タンパク質は、タンパク質を供給するProteins &Labels アプリケーションおよびラベル濃度(最大2つの色素)を使用して定量できます。Proteins and Labelsは、NanoDrop One/OneC、およびNanoDrop 8000分光光度計にあらかじめ構成されているアプリケーションとして使用できます。
以下の表1に、NanoDrop紫外・可視分光光度計で利用可能なタンパク質定量法の使用に役立つガイドを記載します。表2に、どのタンパク質アプリケーションが、各NanoDrop製品であらかじめ構成されたメソッドとして利用可能かが記載されています。
Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外可視分光光度計は、製薬やバイオテクノロジーなどの規制環境で使用できます。
方法 | NanoDrop One/OneCの濃度範囲 | 説明* | 制限事項 |
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A280 |
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A205 |
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Pierece 660 |
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Bradford法 |
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BCA法 |
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Lowry法 |
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*タンパク質アッセイ選択ガイドも参照してください。
タンパク質法/機能 | NanoDrop One/OneC | NanoDrop Eight | NanoDrop Lite |
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A280 | ✓ | ✓ | ✓ |
A205 | ✓ | Coming soon | No |
Pierce 660 | ✓ | Coming soon | No |
Bradford法 | ✓ | Coming soon | No |
BCA法 | ✓ | Coming soon | No |
Lowry法 | ✓ | Coming soon | No |
A260/A280 | ✓ | ✓ | No |
Acclaroコンタミネーション同定 | ✓ | ✓ | No |
カスタマイズ可能なProtein Editor | ✓ | ✓ | No |
研究用にのみ使用できます。診断目的には使用できません。BrijはUNIQEMA AMERICAS LLCの登録商標です。その他のすべての商標は、サーモフィッシャーサイエンティフィックおよびその子会社が所有しています。