NanoDrop装置によるタンパク質定量

Thermo Scientific NanoDrop紫外・可視分光光度計は、A280直接測定、A205直接測定、および比色法のアプリケーションを使用した、タンパク質サンプルの定量をサポートします(下記の表 2を参照)。どのメソッドを使用してNanoDrop紫外・可視分光光度計でタンパク質サンプルを定量するかを決定する際に、いくつかの考慮事項があります。

サンプルは精製タンパク質ですか?

サンプルは精製タンパク質ですか?精製されたタンパク質サンプルは、280 nm での直接吸光度を使用して正確に測定できます。280 nmでの吸光度は、主にアミノ酸のトリプトファン(Trp)およびチロシン(Tyr)の芳香族環によるものです。タンパク質A280は、迅速かつ簡単であり、試薬や検量線が不要で、サンプル消費量が非常に少ないため、最も普及している定量法です。280 nmでの吸光度(A280)を使用して、Beer-Lambertの式A280 = c * ε * b(ここでεは波長依存性タンパク質の消散係数、bは光路長)によってタンパク質濃度(c)を算出します。純粋タンパク質にはそれぞれ固有の消散係数があります。正確な結果を得るには、正しいタンパク質の消散係数εを入力するか、もっとも近いSample Typeを選択する必要があります。NanoDrop OneのProtein Editor機能を使用すると、特定のタンパク質の消散係数を保存できるため、Sample Typeオプションをカスタマイズできます。

NanoDrop One分光光度計でのタンパク質測定は、濃度に加えて、サンプル中の汚染物質に関する情報も提供します。NanoDrop One Thermo Scientific™ Acclaro™のサンプルインテリジェンステクノロジーは、数学アルゴリズムを使用して、タンパク質サンプル中の核酸を検出し、必要に応じて濃度結果を補正します。A260/A280値を確認することによって、サンプル純度も評価できます。A260/A280値が1を超えている場合、タンパク質サンプル中に核酸のコンタミネーションがあることを示している可能性があります。 

細胞抽出物やライセートなどの複合混合物中のタンパク質は、Bradford法BCA 法Lowry 法またはThermo Scientific™ Pierce™ 660 nmアッセイなどのタンパク質比色アッセイを使用して測定するのが最適です。これらのアッセイでは、紫外領域で吸光しA280を増加させる細胞成分からの吸光度を避け、タンパク質に特異的な濃度が得られます。各アッセイのバッファー互換性については、製造元の製品資料を参照してください。上記の比色アッセイは、NanoDrop One/OneおよびNanoDrop 8000装置にあらかじめ構成されているアプリケーションです。(表2

タンパク質またはペプチドにTrp残基 およびTyr残基が含まれていますか?

タンパク質/ペプチドにTrp残基およびTyr残基が含まれていますか?タンパク質のペプチド骨格が190~220 nmで光を吸収します。Tyr残基またはTrp残基を欠くペプチド(そのためA280アプリケーションを使用して測定できない)は、205 nmでの吸光度を使用して定量できます。多量のTrpおよびTyrを持つタンパク質もA205アプリケーションを使用して、Scopesメソッドオプションを選択することにより定量できます。タンパク質A205は、NanoDrop One装置ではあらかじめ構成されているアプリケーションですが。

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タンパク質は標識されていますか?標識抗体または他の蛍光標識されたタンパク質および金属タンパク質は、タンパク質を供給するProteins &Labels アプリケーションおよびラベル濃度(最大2つの色素)を使用して定量できます。Proteins and Labelsは、NanoDrop One/OneC、およびNanoDrop 8000分光光度計にあらかじめ構成されているアプリケーションとして使用できます。 

以下の表1に、NanoDrop紫外・可視分光光度計で利用可能なタンパク質定量法の使用に役立つガイドを記載します。表2に、どのタンパク質アプリケーションが、各NanoDrop製品であらかじめ構成されたメソッドとして利用可能かが記載されています。

図2.NanoDrop OneのProteins and Labelsアプリケーションで測定したフルオレセイン標識 IgG

Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外可視分光光度計は、製薬やバイオテクノロジーなどの規制環境で使用できます。

NanoDrop Oneコンプライアンスソリューションの詳細をご覧ください。

表1:NanoDrop Oneのタンパク質法

方法NanoDrop One/OneCの濃度範囲説明*制限事項
A280
  • 台座:0.06~820 mg/mL BSA(0.03~400 mg/mL IgG)
  • キュベット:0.006~2.38 mg/mL BSA
  • 直接測定、迅速かつ簡単
  • Trp残基およびTyr残基を持つ純粋タンパク質に最適な方法。
  • Beerの式を使用して濃度を算出。正確な結果を得るには、正しい消散係数を入力する必要があります。
  • 検量線が不要。
  • タンパク質混合物を測定する際は、1 Abs = 1 mg/mL「サンプルタイプ」 を使用します。
  • およそ280 nmを吸収する汚染物質やバッファーは、タンパク質の濃度計算に影響を与えます。
  • Thermo Scientific™ Acclaro™サンプルインテリジェンステクノロジーは、タンパク質サンプル中の核酸のコンタミネーションを検出し、濃度結果を補正します。
A205
  • ペプチドごとに異なります。おおよその範囲0.003~10.74 mg/mL 
  • ペプチド骨格の205 nmでの吸光度を測定。Tyr残基およびTrp残基を欠くかほとんどないペプチド用。
  • 多量のTrpおよびTyrを持つタンパク質の測定には、[スコープ]メソッドオプションを使用可能。
  • A205はモル吸光係数が高いため、A280よりも高感度。
  • PBSおよびTEなどの高塩濃度のタンパク質バッファーは近紫外光で吸収を示します。Brij バッファーなどの低塩濃度のバッファーを0.01%に希釈して使用します。
Pierece 660
  • 50~2000 μg/mL BSA(15:1試薬:サンプル容量)
  • 25~1000 μg/mL BSA(7.5:1試薬:サンプル容量)
  • 最も正確で、迅速かつ簡単な比色アッセイ。 
  • ほとんどの界面活性剤、還元剤、およびLaemmliローディングバッファーと適合。 
  • 室温で短いインキュベーション時間でアッセイを実行可能。
  • 室温で保管した試薬。 
  • 検量線が必要。Bradford法と比べて、検量線の直線範囲が拡大。
  • Bradfordアッセイと比べて、タンパク質間のばらつきが少なくなります。
Bradford法
  • 100~8000 μg/mL BSA(50:1試薬:サンプル容量)
  • 15 ~ 100 μg/mL BSA(1:1試薬:サンプル容量)
  • タンパク質に結合した際の595 nmでのCoomassie Blueのシフトを測定。 
  • 室温で実施できる迅速かつ簡単なアッセイ。
  • 直線範囲100~1,000 μg/mL BSA(50:1比の場合)。
  • 検量線が必要。
  • 界面活性剤が試薬沈殿を引き起こすことがあります。 
  • Coomassie色素結合アッセイは、BCAアッセイと比べて、2 倍のタンパク質間のばらつきを示します。
BCA法
  • 200~8000 μg/mL BSA(20:1試薬:サンプル容量) 
  • 10~200 μg/mL BSA(1:1試薬:サンプル容量)
  • タンパク質の存在下で形成される562 nmでのCu-BCAキレートを測定。 
  • 多くの場合、より希釈されたサンプルに使用。
  • 最大5%の濃度で、ほとんどの界面活性剤と適合。
  • Coomassie法と比較して、タンパク質間のばらつきが少ない。
  • 検量線が必要。
  • 還元剤、銅キレート剤、および大容量バッファーはアッセイに干渉することがあります。
Lowry法
  • 200~4000 μg/mL BSA
  • 硫酸銅と酒石酸の複合体を650 nmで測定。
  • カスタムメソッドとして、750 nmでの改変Lowry法を実施可能。
  • 複合体は650~750 nmで測定可能。
  • 検量線が必要。
  • カリウムイオンおよび界面活性剤によって試薬が沈殿します。
  • キレート剤、還元剤、および遊離チオールはこのアッセイに干渉します。

*タンパク質アッセイ選択ガイドも参照してください。


表2:NanoDrop装置によるタンパク質測定

タンパク質法/機能NanoDrop One/OneCNanoDrop EightNanoDrop Lite
A280
A205Coming soonNo
Pierce 660Coming soon
No
Bradford法Coming soon
No
BCA法Coming soon
No
Lowry法Coming soonNo
A260/A280No
Acclaroコンタミネーション同定
No
カスタマイズ可能なProtein Editor
No

研究用にのみ使用できます。診断目的には使用できません。BrijはUNIQEMA AMERICAS LLCの登録商標です。その他のすべての商標は、サーモフィッシャーサイエンティフィックおよびその子会社が所有しています。