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 | TALEN技術の概要転写アクチベーター様（TAL）タンパク質はXanthomonas属の細菌によって生成されます。このタンパク質は広範囲に分泌される植物病原体です。天然のTALエフェクターは宿主の特定のDNA配列に結合し、感染させた植物の遺伝子発現方法を変えて当該疾患プロセスを促進させます。 天然TALエフェクタータンパク質には、2つの特長的なドメイン、エフェクタードメインと非常に特異的なDNA結合ドメインがあります。DNA結合ドメイン構造を操作してタンパク質ドメインを構築します。このドメインはゲノム上のあらゆるDNA配列と特異的に結合します。これらの特異的に改変されたDNA結合タンパク質ドメインは次にカスタマイズされたエフェクタードメイン（例：ヌクレアーゼ、転写アクチベーターまたはリプレッサー）に結合し、標的DNAを正確に操作できるキメラタンパク質を生成します。この配列ターゲッティング技術は、細菌、酵母菌、植物、昆虫、ゼブラフィッシュ、哺乳類など多様な宿主系で機能することが知られています。研究者がデザインしたTALエフェクタータンパク質は、ゲノムを改変するための標的ヌクレアーゼを介して、または高精度な遺伝子発現モデレーターによって、細胞、分子、合成生物学、創薬、バイオ燃料など幅広いライフサイエンス分野のアプリケーションの進歩に役立っています。 | |
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人工DNA結合ドメインを用いたゲノム編集
GeneArt® TALsはXanthomonas由来のTALエフェクターです。DNA結合ドメインは変数のアミノ酸繰り返し配列で構成されています。各繰り返し配列には33～35残基のアミノ酸が含まれ、1つのDNA塩基対を認識します。1つの繰り返し配列には12番目と13番目のアミノ酸からなるDNA結合ドメインを有し，その中にはRVD（repeat variable diresidues）と呼ばれる2アミノ酸残基の可変領域があります。この可変領域により，DNA配列中のそれぞれの塩基を特異的に認識することができます。TALエフェクターの繰り返し配列はモジュール式に集合します。それによりRVDを改変し、特定の標的DNA配列を認識するTALタンパク質を合成します。繰り返し配列に直接結合させて、長いTALエフェクターをゲノム上のあらゆる遺伝子座を特異的にターゲッティングするようデザインすることが可能です。これらの働きについてのアニメビデオを見る
ヌクレアーゼの機能—Fok1ヌクレアーゼペア
遺伝子ターゲッティング （Fok1ヌクレアーゼペア） | 推奨する遺伝子ターゲッティングには以下があります。
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Fok1エンドヌクレアーゼに融合された1対のGeneArt® TALタンパク質を用いて、特定のゲノム遺伝子座で2本鎖DNAを切断することができます（図1）。1対のTALタンパク質を用いてターゲッティングし、オフターゲット効果を減少させます。Fok1ヌクレアーゼドメイン誘導により切断された部位は、その後非相同末端結合または相同組み換えによる修復のいずれかによる内在性の細胞機構によって修復されます。非相同末端結合は変異が起こりやすく、コードするタンパク質コード配列内で生じた場合はしばしばフレームシフト突然変異が起こり、遺伝子を効率的にサイレンシングします。相同DNAの「ドナー配列」を相同組み換えによる修復に用いて、確定した新しいDNA配列を導入することができます。その結果、Fok1エンドヌクレアーゼに融合させたGeneArt® Precision TALまたはGeneArt® PerfectMatch TALを用いて遺伝子サイレンシングを誘導したり、改変したDNAフラグメントをゲノム上の正しい部位に高精度に挿入したりすることが可能になります。
 | 図1 カスタマイズしたTALエフェクターの標的部位をデザインして最大の結合を実現(A) GeneArt® Precision TALsは、お客様からお預かりした配列に特異的なDNA結合タンパク質をコードし、FokIヌクレアーゼドメインに融合させてゲノム編集をします。 当社の初代TALエフェクターでターゲッティングした配列では5'末端にTが含まること、FokIヌクレアーゼを正しい組合せにし、2本鎖切断が行われるようにするためにforward TALエフェクターとreverse TALエフェクター間のスペーシングが13～18 bpでなければなりませんでした。 (B) GeneArt® PerfectMatch TALsは、GeneArt® Precision TALsの5'末端がTであるという制限を無くしました。 GeneArt® PerfectMatch TALsはゲノム全体のあらゆる配列をターゲッティングできます。GeneArt® PerfectMatch TALsでは、2つのTALエフェクター間の最適なスペーシングは15～16 bpです。 |
アクチベーターの機能—アクチベーターVP16またはVP64
転写の活性化 （アクチベーターvp16またはvp64） | 推奨する転写の活性化には以下があります。
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GeneArt® Precision TALEN™のエフェクターは、TALエフェクターのDNA結合部位近くの遺伝子の転写を促進する転写アクチベーターとしての機能も備わっています（図2）。この部位特異的な遺伝子アクチベーターを作製するには、Precision TAL DNA結合ドメインを単純ヘルペス活性化ドメインVP16、またはVP16活性化ドメインの繰り返し配列の四量体であるVP64に融合させます。適切にターゲッティングできた場合は、これらのGeneArt® Precision TALアクチベーターは、自然に発生する割合で標的遺伝子のすべての内因性スプライシング変異体を発現するというメリットがあります。
 | 図2 標的遺伝子の活性化は、GeneArt® Precision TALタンパク質をVP16転写アクチベータードメインに融合させることにより実現します。 |
リプレッサーの機能—KRAB
エピジェネティックな 転写の抑制 [KRAB] | 推奨するエピジェネティックな転写抑制には以下があります。
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GeneArt® Precision TALsは、標的遺伝子をダウンレギュレーションするリプレッサーとして機能するようデザインすることができます。この部位特異的な遺伝子リプレッサーを作製するには、Precision TAL DNA結合ドメインを、強力な転写抑制因子であるKrüppel associated box（KRAB）ドメインに融合させます。
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これまでターゲット遺伝子の活性化および抑制の双方が用いられたことにより、シグナル伝達経路またはその他のさまざまな表現型の発現において特定の遺伝子産物が果たす役割が明らかになりました。
カスタムメイドの機能—マルチクローニングサイトベクター
立体抑制 ＆カスタムデザイン [MCSベクター] | 推奨するカスタムデザインの立体抑制には以下があります。
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 | 図4 エフェクタードメインに融合させたGeneArt® Precision TALEN™タンパク質を用いて、カスタムメイドのエフェクターをゲノム上のあらゆる遺伝子座に特異的にターゲッティングすることができます。 |
ヌクレアーゼの機能—Fok1ヌクレアーゼペア
遺伝子ターゲッティング （Fok1ヌクレアーゼペア） | 推奨する遺伝子ターゲッティングには以下があります。
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Fok1エンドヌクレアーゼに融合された1対のGeneArt® TALタンパク質を用いて、特定のゲノム遺伝子座で2本鎖DNAを切断することができます（図1）。1対のTALタンパク質を用いてターゲッティングし、オフターゲット効果を減少させます。Fok1ヌクレアーゼドメイン誘導により切断された部位は、その後非相同末端結合または相同組み換えによる修復のいずれかによる内在性の細胞機構によって修復されます。非相同末端結合は変異が起こりやすく、コードするタンパク質コード配列内で生じた場合はしばしばフレームシフト突然変異が起こり、遺伝子を効率的にサイレンシングします。相同DNAの「ドナー配列」を相同組み換えによる修復に用いて、確定した新しいDNA配列を導入することができます。その結果、Fok1エンドヌクレアーゼに融合させたGeneArt® Precision TALまたはGeneArt® PerfectMatch TALを用いて遺伝子サイレンシングを誘導したり、改変したDNAフラグメントをゲノム上の正しい部位に高精度に挿入したりすることが可能になります。
| 図1 カスタマイズしたTALエフェクターの標的部位をデザインして最大の結合を実現(A) GeneArt® Precision TALsは、お客様からお預かりした配列に特異的なDNA結合タンパク質をコードし、FokIヌクレアーゼドメインに融合させてゲノム編集をします。 当社の初代TALエフェクターでターゲッティングした配列では5'末端にTが含まること、FokIヌクレアーゼを正しい組合せにし、2本鎖切断が行われるようにするためにforward TALエフェクターとreverse TALエフェクター間のスペーシングが13～18 bpでなければなりませんでした。 (B) GeneArt® PerfectMatch TALsは、GeneArt® Precision TALsの5'末端がTであるという制限を無くしました。 GeneArt® PerfectMatch TALsはゲノム全体のあらゆる配列をターゲッティングできます。GeneArt® PerfectMatch TALsでは、2つのTALエフェクター間の最適なスペーシングは15～16 bpです。 |
アクチベーターの機能—アクチベーターVP16またはVP64
転写の活性化 （アクチベーターvp16またはvp64） | 推奨する転写の活性化には以下があります。
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GeneArt® Precision TALEN™のエフェクターは、TALエフェクターのDNA結合部位近くの遺伝子の転写を促進する転写アクチベーターとしての機能も備わっています（図2）。この部位特異的な遺伝子アクチベーターを作製するには、Precision TAL DNA結合ドメインを単純ヘルペス活性化ドメインVP16、またはVP16活性化ドメインの繰り返し配列の四量体であるVP64に融合させます。適切にターゲッティングできた場合は、これらのGeneArt® Precision TALアクチベーターは、自然に発生する割合で標的遺伝子のすべての内因性スプライシング変異体を発現するというメリットがあります。
| 図2 標的遺伝子の活性化は、GeneArt® Precision TALタンパク質をVP16転写アクチベータードメインに融合させることにより実現します。 |
リプレッサーの機能—KRAB
エピジェネティックな 転写の抑制 [KRAB] | 推奨するエピジェネティックな転写抑制には以下があります。
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GeneArt® Precision TALsは、標的遺伝子をダウンレギュレーションするリプレッサーとして機能するようデザインすることができます。この部位特異的な遺伝子リプレッサーを作製するには、Precision TAL DNA結合ドメインを、強力な転写抑制因子であるKrüppel associated box（KRAB）ドメインに融合させます。
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これまでターゲット遺伝子の活性化および抑制の双方が用いられたことにより、シグナル伝達経路またはその他のさまざまな表現型の発現において特定の遺伝子産物が果たす役割が明らかになりました。
カスタムメイドの機能—マルチクローニングサイトベクター
立体抑制 ＆カスタムデザイン [MCSベクター] | 推奨するカスタムデザインの立体抑制には以下があります。
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| 図4 エフェクタードメインに融合させたGeneArt® Precision TALEN™タンパク質を用いて、カスタムメイドのエフェクターをゲノム上のあらゆる遺伝子座に特異的にターゲッティングすることができます。 |
ターゲットの無制限選択
ターゲットの選択は実質的に無制限GeneArt® Precision TALエフェクターがDNA配列に正確に結合すると予測されるため、これによりゲノム上のあらゆる配列をターゲッティングすることが可能になります。まずエフェクタードメインを選択し、次にTALエフェクターがターゲット遺伝子を編集、活性化または抑制するかどうかを判断します。
GeneArt® TALエフェクターはGateway® エントリークローンという形で凍結乾燥DNAとして提供いたします。Gateway® エントリークローンにはDNA結合タンパク質ドメインを特定する（お客様からお預かりしたDNA配列に特異的で、現在利用可能ないくつかのエフェクタードメインの中の1つまたはカスタムメイドのエフェクタードメイン1つに融合させた）DNAが含まれます。
当社が現在取り扱っていないエフェクタードメインを組み込みたい場合は、エフェクタードメイン配列の代わりにMCS（マルチクローニングサイト）配列をご提供します。こちらはオプションサービスとなり、あらゆるタンパク質をコードする配列を挿入することが可能です。残ったTALタンパク質で、このエフェクターをゲノム上のどこでも配列特異的に導入できます。当社はさらにgene synthesis servicesを提供しており、お客様がテンプレートをお持ちでないどのようなエフェクタードメインをも構築いたします。
GeneArt® Precision TALsとGeneArt® PerfectMatch TALsでは、Gateway®エントリークローンとともに、お客様が指定したDNA配列に特異的でかつお客様が指定したエフェクタードメインに融合した、DNA結合タンパク質をコードする配列をご提供します。
TALENを用いたゲノム編集の成功の確認
遺伝子座に特異的な2本鎖DNA切断部位の検出
GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kitは、遺伝子座に特異的な2本鎖DNA切断部位を検出するためのシンプルで迅速かつ信頼できるキットです。アッセイでは、所定の遺伝子座でDNAを切断するCRISPR、TALs、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどのゲノム編集ツールの切断効率を評価します。この切断部位はゲルを用いた解析で簡単に検出および定量化ができます。
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GeneArt® PerfectMatch TALsで効率的なゲノム編集を実現
切断効率を評価するアッセイでは、 GeneArt® PerfectMatch TALsの機能は、初代TALエフェクターと同等またはそれよりも優れていることが示されました。 293FT細胞 (A) およびHeLa細胞 (B) では、GeneArt® PerfectMatch TALsの機能は、forward TALエフェクターとreverse TAL エフェクターの標的配列の前に異なる（同一でない）塩基がある場合、現在のTALエフェクターと同等かそれよりも優れていることを示しています。 赤い矢印は、GCDアッセイで複数のバンドが存在していた場合のGCD酵素による切断産物を指しています。
遺伝子抑制
遺伝子抑制 内因性Sox2の抑制：TALリプレッサーによる（コントロールと比較した）mRNAレベル 結合コントロールとしてのmcsベクターとベクターのみのコントロールとしてのpcDNA3
最適なノックダウンとオフターゲットの減少
最適なノックダウンとオフターゲットの減少 293FT細胞内の内因性遺伝子Sox2に対するTAL抑制の経時的変化 TALリプレッサーは遺伝的に引き継がれ、ピジェニックに遺伝子を抑制します。 293FT細胞は図に示されたプラスミドによりトランスフェクションされました。 細胞をそれぞれ異なる時間に回収し、標的遺伝子のmRNAレベルをqRT-PCRで定量し、βアクチンレベルまで戻しました。
遺伝子修飾効率を最大化
Lipofectamine® 3000試薬を用いてGeneArt® Precision TALsまたはCRISPRの切断効率を向上させることができます。
Lipofectamine® 3000試薬を用いてトランスフェクションした後のGeneArt® TALsとCRISPRsの切断効率の向上 TALENsとCRISPRsは、(A) U2OS と (B) HepG2細胞株のAAVS1遺伝子座をターゲッティングしました。 GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kitを用いて切断部位をアッセイしました。
- アプリケーションノート「Lipofectamine® 3000が生物学的関連性のある細胞モデルでのゲノム編集結果を向上させる」
Silencer® Select siRNAでゲノム全体のスクリーニングした結果、パーキンソン病の新たな創薬ターゲットが得られました。
このNCATS、NIHからNature に掲載された論文は、パーキンソン病の新たな創薬ターゲットを効率的に特定して、配列を高スループットにスクリーニングするSilencer® Select Genome-Wide siRNAライブラリーの有用性を明らかにしています。この作業のために採用されたワークフローには当社の他の製品Lipofectamine® RNAiMAX Transfection ReagentおよびGibco®培地が組み込まれています。主要な創薬ターゲットの最終バリデーションは、TALエフェクターエンドヌクレアーゼ（TALEN）技術を用いてノックアウト細胞株を作製できたことで達成されました。
TALENに関するよくある質問
Q. TALEN™はどの程度特異的なのですか？ オフサイトターゲッティングとは？
A.Nature Biotechnologyに掲載されたPrashant Maliの最近の論文では、TALEN™は1～2個のミスマッチは許容範囲内ですが、大部分が3 bpのミスマッチだと許容できる可能性が低くなります。
Q. TALEN™を介したKO株またはKI株はGMOであると考えられますか？
A. はい。KO株およびKI株は、天然の遺伝子配列を変異または欠失、あるいは希望の部位に新たな配列が挿入されています。これにより、天然の遺伝子情報を操作できますが、この技術は責任をもって使用する場合、例えばインスリンを生成するために酵母菌を改変する、またはより経済的で臨床的に価値のある製品として細胞を改変するなどした場合、非常に有用性の高いアプリケーションになります。
Q. TALEN™ベクターはどのくらいの大きさで構築できますか？
A. 3.3 kb.
Q. TALEN™をレトロウイルスで導入することはできますか？
A. はい。ウイルスを用いた導入がお客様のお好みのオプションであるなら、TAL導入にはレンチウイルス系よりもアデノウイルス系の使用をおすすめします。
Q. TALEN™は変性した結合部位を認識できますか？
A. 慎重にデザインすることにより、それらの部位を非常に特異的に改変することが可能です。注：最近の報告では、標的DNA配列の1～3 bpのミスマッチはかなりの程度まで許容可能であることが示されています。
Q. KO株またはKI株を用いた実験をしたいのですが、どのくらいの日数でTALEN™を入手できますか？
A. お客様からのご注文を受け付けてから通常2週間以内に製造が行われます。
Q. TALEN™の最善の導入方法を教えてください。 トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはレトロウイルスの導入の場合はどうですか？
A. 標準的な試験に用いる細胞株（293、HeLaなど）の場合、脂質によるトランスフェクションを介してmRNA と DNAを導入するのが最善の方法です。また、mRNAの導入により、導入遺伝子がインテグレーションされるリスクを減じることができます。幹細胞の場合はエレクトロポレーションを選択するのが最善の方法です。
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