Pierce™ Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit

Das Thermo Scientific Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit nutzt die Vernetzung von Chemie, um IP-Antikörper auf qualitativ hochwertigen Protein A/G Magnet-Beads kovalent immobilisieren zu können, um eine effektive Immunpräzipitation und Co-Immunpräzipitation zu ermöglichen.

Da dieses magnetische IP-Verfahren die kovalente Bindung des spezifischen Antikörpers zur Immunpräzipitation beinhaltet, können Zielproteine oder Co-IP-Proteinkomplexe eluiert und ohne Antikörperfragmente analysiert werden, da der Antikörper auf den Beads verbleibt. Das Kit enthält ein optimiertes Protokoll und alle Puffer und Reagenzien, die für die Herstellung von hochergiebigen IP- oder Co-IP-Antikörpern mit Antikörpern erforderlich sind, die sich an Protein A/G binden und entweder manuelle oder automatisierte magnetische Trennungswerkzeuge verwenden.

Merkmale des Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kits:

• Antikörperfreie IP: Antikörper werden irreversibel an den Magnet-Beads angebracht, was zu einer vernachlässigbaren Co-Elution intakter Antikörper oder schwerer und leichter Ketten mit dem gereinigten Antigen führt
• Praktisch: Das IP/Co-IP-Kit enthält Magnet-Beads und alle wesentlichen Puffer für eine optimale Immunpräzipitation
• Schnell: vollständige Vernetzung und Immunpräzipitation in weniger als 3 Stunden
• Effizient: Immunpräzipitation mit der Hälfte des empfohlenen Volumens an Magnetpartikeln im Vergleich zu anderen Magnet-Beads
• Kompatibel: Magnet-Beads in Verbindung mit rekombinantem Protein A/G gewährleisten die Kompatibilität mit den meisten primären Antikörpern, ob von Maus oder Kaninchen
• Skablierbar: verwenden Sie nur die Antikörpermenge, die für ein einzelnes IP-Experiment erforderlich ist, oder bereiten Sie eine größere Menge antikörpervernetzter Magnet-Beads für mehrere Experimente vor

Das Protokoll für das Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit bindet IP-Antikörper an Protein A/G Magnet-Beads und vernetzt dann den Antikörper mit Hilfe von Disuccinmidyll Suberat (DSS) kovalent mit den Beads. Die Antikörper-vernetzten Beads werden dann mit Zelllysat oder Gewebeextrakt inkubiert, der das interessierende Proteinantigen enthält, wodurch sich der Komplex Antigen:Antikörper bilden kann. Die Beads werden gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen, und ein Elutionspuffer mit niedrigem pH wird verwendet, um gebundenes Antigen von den antikörpervernetzten Beads zu dissoziieren. Neutralisierungspuffer ist enthalten, um die Ausfällung des isolierten Antigens zu verhindern und die Proteinaktivität in Downstream-Prozessen sicherzustellen. Lane Marker Probenpuffer ist im Lieferumfang enthalten, um Proben für die SDS-PAGE-Analyse vorzubereiten. Das Protokoll ist für 2 bis 10 µg IP-Antikörper optimiert. Für optimale Co-IP-Ausbeute verwenden Sie 5 bis 10 µg Antikörper. Die Beads werden manuell mit einem Magnetständer oder durch Automatisierung mit einem Gerät wie dem Thermo Scientific KingFisher Flex Instrument aus der Lösung entfernt.

Herkömmliche IP (ohne kovalente Antikörperanhaftung) bieten im Allgemeinen höhere Antigenausbeuten als IP-Protokolle, die eine Vernetzung verwendeten. Dies liegt daran, dass der Vernetzungsprozess zwangsläufig zum Verlust einiger funktionaler Antikörper-Bindungsstellen führt. Um diese Einschränkung mit der Vernetzungsmethode zu überwinden, kann es erforderlich sein, etwas größere Mengen an IP-Antikörpern in der IP-Vernetzungsmethode zu verwenden als im äquivalenten herkömmlichen IP-Verfahren. Der Vorteil des Verfahrens der vernetzten Immunpräzipitation liegt natürlich in den Western Blots ohne störende Antikörperbänder.

Protokoll-Zusammenfassung
1: Vorwäsche von Beads mit 1x Kopplungspuffer.
2: Binden Sie Antikörper für 15 Minuten an Protein A/G-Magnet-Beads.
3: Waschen Sie die Beads dreimal mit 1x Kopplungspuffer.
4: Vernetzung von Antikörpern an Beads mit DSS für 30 Minuten.
5: Waschen Sie das Bead dreimal mit Elutionspuffer und dann zweimal mit IP-Lyse/Waschpuffer.
6: Inkubieren Sie das Zelllysat mit vorbereiteten Beads für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C.
7: Waschen Sie die Beads zweimal mit IP-Lyse/Waschpuffer und dann einmal mit gereinigtem Wasser.
8: Eluiert gebundenes Antigen.

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