Das Ambion™ Cells-to-cDNA™ II Kit (zum Patent angemeldet) produziert cDNA aus kultivierten Säugetierzellen in weniger als 2 Stunden. Eine RNA-Isolierung nicht erforderlich. Dieses Kit enthält Reagenzien für 100 Reaktionen und eignet sich ideal für diejenigen, die Reverse Transkriptionsreaktionen an einer geringen Zellanzahl oder an zahlreichen Zellproben durchführen möchten, oder für Wissenschaftler, die mit der RNA-Isolierung nicht vertraut sind.

• Eine RNA-Aufreinigung ist nicht erforderlich
• Von Kulturzellen zu cDNA in weniger als 2 Stunden
• Erkennen Sie seltene Botschaften in 1 einzigen Zelle
• Ideal für Labore, die nicht für die RNA-Isolierung ausgestattet sind

Ideal für RT-PCR-Anwendungen
Das Cells-to-cDNA™ II Kit (zum Patent angemeldet) vereint die RNase-Inaktivierung mit der DNase I-Behandlung in einem RT-PCR-kompatiblen Zelllysepuffer, der die RNA-Isolierung völlig überflüssig macht. Die meisten Zelllysepuffer enthalten starke Denaturierungsmittel, die, wenn sie in enzymatische Reaktionen übertragen werden, die meisten Enzyme hemmen oder inaktivieren würden. Wenn ein Lysepuffer ohne starke Denaturierungsmittel verwendet wird, kann die endogene RNase schnell Zell-RNA abbauen. Das Cells-to-cDNA™ II Kit enthält einen neuartigen Zelllysepuffer, der endogene RNasen inaktiviert, ohne die nachgelagerten enzymatischen Reaktionen zu beeinträchtigen. Nach der Inaktivierung der RNasen kann das Zelllysat direkt einer cDNA-Synthesereaktion hinzugefügt werden. Cells-to-cDNA™ II ist sowohl mit ein- als auch zweistufigen RT-PCR-Protokollen kompatibel.

Quantitativ – Lineare Ergebnisse und keine nachweisbare DNA-Kontamination
Um das quantitative, lineare Ansprechen von Cells-to-cDNA™ II auf Variationen der eingegebenen Zellenzahl zu veranschaulichen, wurde mit dem ABI 7700 Sequenzdetektionssystem ein quantitatives RT-PCR-Experiment in Echtzeit durchgeführt. Die Aufzeichnung des Zyklusschwellenwerts (Ct-Wert) im Vergleich zur Zellkonzentration für GAPDH ergab eine Standardkurve mit einer Korrelation von 0,99. So liefert Cells-to-cDNA™ II lineare Ergebnisse für 1 bis 10.000 Zellen/µl in einem Echtzeit-Assay mit zweistufiger RT-PCR. Es ist auch zu beachten, dass die Minus-Template PCR-Kontrolle für das GAPDH-Experiment negativ war, was auf eine vollständige Entfernung genomischer DNA hindeutet.

Einfaches Verfahren
Das Kit enthält alles, was Sie benötigen, um von kultivierten Zellen bis hin zu PCR-fähiger cDNA in weniger als 2 Stunden zu gelangen. Eine RNA-Isolierung ist nicht erforderlich. Die Zellen werden zuerst mit PBS gewaschen und anschließend im Zelllysepuffer resuspendiert. Kurzes Erhitzen lysiert gleichzeitig die Zellen und inaktiviert RNasen. Dann kann eine optionale Verdauung von DNase zum Abbau von genomischer DNA durchgeführt werde, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung. Ein Bruchteil des Zelllysats wird dann in einer reversen Transkriptionsreaktion mit den enthaltenen Reagenzien verwendet.

Zubehör:
SuperTaq™ Thermostable Taq DNA Polymerase wird empfohlen und ist separat erhältlich (SKU-Nr. AM2050 und AM2052). Für eine optimale Amplifikation von Fragmenten mit einer Größe von mehr als 1 kb empfehlen wir Ihnen SuperTaq™ Plus thermostabile Taq DNA-Polymerase (SKU-Nr. AM2054 und AM2056).