Thermo Scientific Pierce RNA 3'末端デスチオビオチン化キットには、RNAを簡単かつ効率的にデスチオビオチン標識するための試薬が含まれており、プローブとして使用したり、RNA結合タンパク質を濃縮するための抗体代替品として使用したりできます。

RNA 3'末端デスチオビオチン化キットの特長：

•非放射性 – 単一ビオチン標識には、放射活性と同様の検出感度があります
• 使いやすい – RNAリガーゼと最適化された反応バッファーが付属しています
• 経済的 – 合成ビオチン化RNAプローブを購入するコストが若干かかるだけです
• 末端標識化 – RNAの二次構造に軽微な障害が生じます
• フレキシブル – デスチオビオチン標識はストレプトアビジンレジンの検出に使用したり、そのアフィニティーハンドルとして使用したりできます

Pierce RNA 3'末端デスチオビオチン化キットは、T4 RNAリガーゼを使用して、一本鎖RNAの3'末端を標識化するよう最適化されています。標識化すると、RNAはゲルシフトEMSA反応、ノーザンブロットおよびタンパク質-RNA相互作用実験のプローブまたはターゲットとして使用できます。ストレプトアビジンアフィニティーレジンを使用すると、デスチオビオチン化RNAもRNA結合タンパク質（RBP）を濃縮する目的で使用できます。リボ核タンパク質複合体が穏やかに溶出できるように、デスチオビオチンタグがストレプトアビジンに結合するためです。この標識化キットは、Thermo Scientific Pierce磁気RNA-タンパク質プルダウンキットにもコンポーネントとして含まれています。

内容：
デスチオビオチン化シチジンビスホスフェート、T4 RNAリガーゼおよびバッファー、非標識RNAオリゴヌクレオチド（ポジティブコントロールとして使用）、ビオチン化RNAプローブ標準、RNase阻害剤、グリコーゲンおよびライゲーション促進試薬

アプリケーション：
• ノーザンブロッティング
• EMSA
• RNA結合タンパク質（RBP）の濃縮

このRNA標識化キットはT4 RNAリガーゼを使用して、単一デスチオビオチン化シチジンビスホスフェートを一本鎖RNAの3'末端に付加します。各標識反応は50 pmolのRNAを前提に設計されています。ただし、必要に応じて反応をスケーリングできます（1 pmol～1 nmolはテスト済みです）。この反応は20倍のデスチオビオチン化ヌクレオチドを使用し、37℃で30分間（複雑なRNAが少ない場合）、4℃～16℃で一晩（長い RNA または複雑なRNAが多い場合）のインキュベーション時間が必要です。複雑なRNA構造の標識効率を最適化するには、RNA対ヌクレオチド比を変更するか、インキュベーション時間を延長するか、DMSOを追加してRNA構造を弛緩させます。エタノールで有機抽出および沈降すると、デスチオビオチンで標識化されたRNAは下流アプリケーションでいつでも使用できます。

さまざまなRNA分子を使った実験例によって、ライゲーション反応の堅牢性が示されています。合成RNAおよびin vitro転写されたRNAが評価され、合成ビオチン化RNAを100%標識コントロールとして使用した半定量ドットブロットによって、ライゲーション効率が特定されます（表）。ライゲーション効率はすべて50%を超えており、多くが70%を超えています。このキットのコントロールRNAは、効率が90%を超えているため、反応条件および試薬全体のインジケーターとして役立ちます。有意な二次構造を持つRNAにはさらなる最適化が必要であり、in vitro転写されたRNAにはライゲーション後のリフォールディングが必要でした。

let-7 miRNA：Lin28相互作用を含むプルダウンアッセイによって、デスチオビオチンで標識化されたRNAの実験機能が示されます。発生学的に調節されているLin28タンパク質はlet-7 miRNA処理の選択的な阻害剤で、let-7 pre-miRNAのループ領域に結合します。この相互作用をテストするために、let-7 miRNAのループ部分をデスチオビオチン化シチジンで末端標識化して、ストレプトアビジン磁気ビーズに付加しました。次に、タンパク質-RNA結合バッファーの中で、胚性癌腫細胞ライセート（NCCIT）を使ってビーズをインキュベートしました。サンプルはウェスタンブロッティングで溶出して分析しました。その結果、標識let-7 miRNAではNCCITライセートからLin28タンパク質が特異的に濃縮されましたが、非標識RNAでは濃縮されませんでした。

このキットはPierce Magnetic RNA-Protein Pull-down Kitにも含まれており、この標識化キットとともに最適化された結合、洗浄、および溶出バッファーを利用して、RNA結合タンパク質を濃縮します。