Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells

Thermo Scientific™リソソーム濃縮キット（組織および培養細胞用）では、細胞および組織の粗抽出物からのインタクトなリソソームの分離と濃縮ができます。このキットは、25の抽出物を調製するのに十分な試薬を提供し、汚染細胞構造からリソソームを密度ベースで分離するためにOptiPrep細胞分離培地を使用します。分離されたリソソームは、プロテオミクス研究用の2D/MS、電子顕微鏡、疾患プロファイリングおよび遺伝子発現、シグナル伝達、相互作用または局在など、多くの下流アプリケーションに使用できます。

リソソーム濃縮キット（組織および培養細胞用）の特長：

•効率的かつ使用が簡単 — キットの試薬と勾配遠心法で汚染構造からオルガネラを単離
• 適合性 — 2D/MS、電子顕微鏡解析、疾患プロファイリング、遺伝子発現解析、シグナル伝達、および相互作用や局在性研究などの下流アプリケーション用に試料を調製
• 完全 —キットには25回分の試薬が含まれています

このキットにより、細胞や組織から無傷の細胞小器官を濃縮できます。各キットは、汚染細胞構造からオルガネラを単離させるために密度勾配遠心法を採用しています。分離したオルガネラは、2D/MS、電子顕微鏡解析、疾患プロファイリング、遺伝子発現解析、シグナル伝達、および相互作用や局在性研究を含む多数の下流アプリケーションに利用できます。

組織からのオルガネラの濃縮：
生後6～8週間のメスのSprague-Dawleyラット、平均体重160 gで、一晩絶食させてからと殺しました。肝臓と腎臓を切除し、氷冷PBSで洗浄し、外科用ハサミを使用して細かく切り刻み、Polytron™組織ティアラｰを使用して、8000rpmで45秒間、氷冷試薬Aでホモジナイズしました。続いて試薬Bを添加し、ホモジネートを遠心分離して細胞破片を除去しました。その結果得られた上清を、OptiPrep™細胞分離培地の不連続勾配に重ね、遠心分離して標的細胞小器官を分離および濃縮しました。ターゲットバンドをグラジエントから除去し、ウェスタンブロッティングで分析しました。

細胞からのオルガネラの濃縮：
いくつかの細胞株からリソソーム単離について調べました。A431 [American Type Culture Collection（ATCC™ Resource Center）、 #CRL-1555]、HeLa（ATCC、#CCL-2）、およびHepG2細胞（ATCC、#HB-8065）。細胞は80～90%のコンフルエンシーまで増殖しました。約50～200 mgのウェット細胞ペーストを回収し、リソソーム濃縮用に処理しました。細胞に氷冷リソソーム試薬Aを添加し、15Wの電力を供給する15パルスのMisonix Sonicator 3000を使用して溶解しました。

続いて、リソソーム試薬Bを添加し、ホモジネートを遠心分離して細胞破片を除去しました。その結果得られた上清を、OptiPrep細胞分離培地のいくつかの不連続グラジエント上に重ね、遠心分離して標的オルガネラを分離および濃縮しました。ターゲットバンドをグラジエントから除去し、総ライセートとともにタンパク質量で標準化し（特に指定がない限り）、ウェスタンブロッティングで分析しました。

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