キットには、凝集体から変性・可溶化された組み換えタンパク質について天然の構造と機能を回復するリフォールディングの最適バッファー条件を検討するための試薬と完全な戦略が含まれます。9種類のベースリフォールディングバッファーが添付されており、タンパク質凝集抑制のための強弱の変性条件の範囲を含むマトリックスを形成します。リフォールディングされるタンパク質の種類によっては、付属の添加物を追加マトリックス因子として使用します。バッファー成分は3種類の濃度レベルで試験されており、1回の実験で広範なスペクトルのフォールディング条件に対応可能です。マトリックス条件を目的タンパク質に合わせて調整できるので、リフォールディング収量を最大化しながら試料の無駄遣いや不必要な分析を回避します。Pierce Protein Refolding Kitには、封入体の分離、可溶化および精製、リフォールディング条件の最適化、またリフォールディング収量分析の詳細に関する網羅的なリフォールディングガイドが含まれます。
注意事項:以下のセクションは、Pierce Protein Refolding Kitの開発に関して報告されている元のPreviewsの記事に基づいています。このキットは、当初「Pro-Matrix」と呼ばれていました。
Methods Lysozymeは、4℃(8M GdnHCl)、10 mM DTT、50 mM Tris、pH 8.0(20 mg/mL)で一晩変成しました。還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、およびDTTを、マトリックスレイアウトで決定されたリフォールディング緩衝液に追加しました(表3)。すべての溶液を4°Cに平衡化しました。可溶化リゾチームをリフォールディング緩衝液に加える直前に、8M GdnHCl、50 mM Tris、pH 8.0で平衡化したタンパク質脱塩スピンカラムを使用してDTTを除去しました。次に、リゾチームを最終濃度1 mg/mLでリフォールディング緩衝液に添加しました。この添加により、0.4M GDNHClがベースリフォールディング緩衝液に供給されます。リフォールディングは4°Cで18時間実施されましたリフォールディングの収量は、Tecan(tm) SPECTRAFluor Plus Systemを使用して、EnzChek(tm)リゾチームアッセイキット(分子プローブ)でリゾチーム活性を測定することにより求めました。
Pierce Protein Refolding Kitを用いた還元および変性リゾチームのリフォールディング結果を表3に示します。この例では、天然状態でのジスルフィド結合の存在が不明であるかのようにリゾチームを処理しました。天然リゾチームの再形成は、タンパク質リフォールディングマトリックス中に存在するもっとも低低い変性剤の濃度および高い濃度(試験番号1、2、9)で抑制されました。また、DTT(試験番号1、6、8)の存在によりリフォールディングが抑制され、リゾチームのフォールディングにおけるジスルフィド結合の再形成の重要性が示されました。この実験で回収されたリゾチームの最大の活性は、1.4M GdnHCl、0M L-アルギニン、2 mM GSHを含む試験7で達成されました:0.4 mM GSSGで、リフォールディングされている可溶化リゾチームの90%以上を表しています。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.