Precision gRNA合成キットは、トランスフェクションに対応したCas9タンパク質／gRNAリボヌクレオタンパク質（Cas9 RNP）用のTrueCut™ Cas9 Protein v2との複合に対応するガイドRNA（gRNA）を迅速に合成するための完全なシステムです。このCas9 RNP形式は、当社のTrueCut Cas9タンパク質v2とともに、さまざまな懸濁液および接着細胞株で検証されており、切断効率は>70%、かつ毒性の兆候は認められません。gRNAテンプレートは、ターゲット配列をコード化する2本の短い1本鎖オリゴで開始し、短い「ワンポット」PCR反応で、T7プロモーターとのアセンブリを生成します。得られたアセンブリは次に、インビトロ転写（IVT）反応におけるテンプレートとして用いられ、その後に迅速な精製ステップが進行し、トランスフェクションに対応したgRNAが、わずか4時間で得られます。生成するgRNAは、即トランスフェクションに対応した当社製Invitrogen™ CRISPRヌクレアーゼmRNAを使用して共トランスフェクションを実施することもできます。タンパク質およびmRNA Cas9フォーマットは、いずれもプラスミド操作を必要としないため、ハイスループットとマルチプレックスゲノムワイドの細胞工学アプローチが可能です。

Precision gRNA合成キットの特長は以下のとおりです：
•テンプレートのアセンブリを含めてわずか4時間で行われるgRNAターゲットの高速アセンブリと合成
• 高収率（>10 ug）で高濃度（>200 ng/uL）のgRNA

gRNA配列を取得する方法
CRISPRテクノロジーによるゲノム編集を行うには、目的のターゲット配列でゲノムDNAを切断するためのノンコーディングガイドRNA（gRNA）が必要です。gRNAには、ターゲット特異的CRISPR RNA（crRNA）、およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）の2つの分子成分が含まれており、これらは1つの転写産物に結合されています。ターゲットの配列（20塩基）は、Cas9が結合を開始できるように、PAMモチーフ（NGG）のすぐ上流に存在する必要があります。PAMはターゲットDNA上にのみ存在し、ターゲット特異的なCRISPRの配列の一部ではありません。gRNAおよびPAMモチーフは、Cas9ヌクレアーゼをターゲットのゲノム配列に誘導して複合体を形成し、PAM部位から上流に、2本鎖平滑DNAブレーク（DSB）の3つのヌクレオチドを作成します。

当社製CRISPR検索および設計ツールを使用して、ヒトゲノムおよびマウスゲノム中のすべての遺伝子に固有の、600,000を超えるgRNA配列のデータベースを検索できます。Invitrogenの設計済みgRNAは、遺伝子ノックアウト用に最適化されており、通常、1遺伝子あたり最初の3つの転写エクソンを標的とします。検索結果には、潜在的なオフターゲット効果、潜在的な結合部位、およびgRNA位置を持つエクソンマップを最小限に抑えることを前提とした推奨事項が含まれます。このツールを使用して、目的のシーケンスを解析し、独自のCRISPRシーケンスを設計もできます。

gRNAを作成する方法
いったんgRNA配列を選択した後、gRNAを作成するための3つのオプションから選択します：
1.TrueGuide合成ガイドRNA—設計済みgRNAのカタログから選択するか、当該配列をTrueGuide gRNA Ordering Toolにアップロードします
2. Precision gRNA合成キット（このページ）—テンプレートアセンブリを含め、わずか4時間で行われるトランスフェクションに即対応したgRNA
3. ゲノムエンジニアリングサービス—時間と労力を節約し、当社のカスタムサービスチームに、インビトロにての転写（IVT）gRNA配列の設計、合成、および精製をご依頼ください。サービスの見積りやご注文については、カスタムサービス部門（1-800-955-6288 x45682）またはgemservices@thermofisher.comまでお問い合わせください。