GeneArt™ CRISPRヌクレアーゼmRNAは、優れた品質と製品性能の向上を実現するために、新しい製造プロセスを使用して配合されています。この野生型Cas9 mRNAには、2つの核移行シグナル（NLS）があります。2つのNLSを持つCas9コンストラクトは、Cas9タンパク質を核に標的とすることで、より効率的であることが示されています（1）。mRNAフォーマットはトランスフェクションにすぐに使用でき、CRISPRベクターシステムを使用する際に必要な、時間のかかるクローニングステップを回避できます。Cas9 mRNAはターゲット特異的ガイドRNA（gRNA）と共トランスフェクションされ、Cas9タンパク質を目的のゲノム遺伝子座に誘導して二本鎖分解を作成します。完全なRNAフォーマットは、プラスミドベースのCas9システムよりも小さなペイロードで、細胞への導入が改善され、ゲノム編集効率が向上します。さらに、Cas9 mRNAは、複数のgRNAを用いたマルチプレックスアプローチで使用できます。このアプローチを使用すると、特定のターゲットに最適なgRNA配列を特定することや、1回のトランスフェクションで複数のゲノム遺伝子座を編集することができます。

gRNA配列のゲノム編集を行う方法
CRISPR技術を用いる遺伝子編集には、目的の配列でゲノムDNAを切断するためのノンコーディングガイドRNA（gRNA）が必要です。gRNAには、ターゲット特異的CRISPR RNA（crRNA）、およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）の2つの分子成分が含まれており、これらは1つの転写産物に結合されています。ターゲットの配列（20塩基）は、Cas9が結合を開始できるように、PAMモチーフ（NGG）のすぐ上流に存在する必要があります。PAMはターゲットDNA上にのみ存在し、ターゲット特異的なCRISPRの配列の一部ではありません。gRNAおよびPAMモチーフは、Cas9ヌクレアーゼをターゲットのゲノム配列に誘導して複合体を形成し、PAM部位から上流に、二本鎖平滑DNAブレーク（DSB）の3つのヌクレオチドを作成します。

当社製GeneArt CRISPR検索および設計ツールを使用して、ヒトゲノムおよびマウスゲノム中のすべての遺伝子に固有の、600,000を超えるgRNA配列のデータベースを検索できます。GeneArt設計済みgRNAは、遺伝子ノックアウト用に最適化されており、通常、1遺伝子の最初の3つの転写エクソンを標的とします。検索結果には、潜在的なオフターゲット効果、潜在的な結合部位、およびgRNA位置を持つエクソンマップを最小限に抑えることを前提とした推奨事項が含まれます。このツールを使用して、目的のシーケンスを解析し、独自のCRISPRシーケンスを設計もできます。

gRNAを作成する方法
いったんgRNA配列を選択した後、gRNAを作成するための3つのオプションから選択します：
1.GeneArt Precision gRNA合成キットは、テンプレートアセンブリを含め、わずか4時間でトランスフェクションに即対応できるgRNAです。
2.GeneArt CRISPR Stringsは、インビトロ転写用のT7プロモーターまたはトランスフェクションに即対応するフォーマットのU6プロモーターを持つ、gRNAからなる合成DNAテンプレートです。GeneArt CRISPR Search & Design Toolから購入されるか、GeneArt CRISPR Strings DNAオーダーフォームに記入して、GeneArtSupport@lifetech.comまでお送りください。
3.時間と労力を節約し、当社のGeneArtカスタムサービスチームにインビトロにての転写（IVT）gRNA配列の設計、合成、および精製をご依頼ください。サービスの見積りやご注文については、カスタムサービス部門（1-800-955-6288 x45682）またはcustom.services@lifetech.comまでお問い合わせください。

リソース
実証済みプロトコル：CRISPR-Cas9を用いた幹細胞の遺伝子工学

リファレンス
1.Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.（2013）、CRISPR/CASシステムを用いたマルチプレックスゲノムエンジニアリング（Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems）。Science 339(6121):819-23。