LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System

LeukoLOCK™トータルRNA単離システムは、全血の細胞分画、トータルRNAの安定化、白血球集団からの抽出を行う革新的な手法です。このキットは、LeukoLOCK™分画および安定化キット（別途購入可能、カタログ番号AM1933）とLeukoLOCK™トータルRNA単離キットで構成されています。

•数分で全血から白血球を分画します
• 白血球からトータルRNAを抽出します
• 追加のグロビン低減ステップは不要です
• RNAを安定化して発現プロファイルを維持します
• 白血球を室温で数日間保持します

LeukoLOCK™システムは、ヒト血液での使用に対して最適化されています。血液は細胞情報が格納されている場所ですが、全血から調製されたRNAに含まれるグロビンmRNAは、下流の発現プロファイリングアプリケーションに干渉する可能性があります。LeukoLOCK™システムは、全血から白血球を単離するフィルターベースの白血球除去技術と、フィルター上の細胞を安定化させるRNAlater™ソリューションを採用しています。赤血球を取り除くことにより、取り込まれた白血球から精製されるRNAからは、本質的にグロビンmRNAが除去されることになるため、発現プロファイリングなどのアプリケーションにおけるサンプルの有用性が改善されます（図を参照）。

白血球の捕捉と安定化
抗凝固処理された9～10 mLの血液サンプルがLeukoLOCK™フィルターを通過すると、全白血球集団を捕捉しながら、赤血球（網状赤血球を含む）、血小板、血漿を除去します。フィルターは、リン酸緩衝生理食塩水で洗い流した後でRNAlater™溶液で洗浄することで、回収した白血球中のRNAを安定化させます（プロトコル概略図を参照）。RNAは直ちに単離することもできますが、安定化した細胞を室温で数日間、または–20℃あるいは–80℃で長期保管することもできます（図を参照）。

RNA単離
RNAを精製するには、まず回収した細胞をグアニジンチオシアン酸ベースの溶液で破壊します。この溶液により、RNAを放出しながら、同時にヌクレアーゼが不活性化されます。細胞ライセートが回収され、プロテイナーゼKで短時間処理されます。その後、MagMAX™磁気ビーズベースの技術を使用した洗浄によってライセートから精製され、TURBO DNase™によるDNase処理を行った後で、最終的なクリーンアップが行われます。

発現解析
精製されたRNAは、定量的RT-PCRおよびマイクロアレイ発現解析の両方によって、信頼性の高いトランスクリプトームプロファイリングに適合していることが検証されています（図を参照）。一般的に使用されている血中RNAの単離手順で処理されたRNAと比較して、LeukoLOCK™システムで単離されたRNAは、増幅後により長い中央値を持つaRNAを生成し、グロビンmRNAを除去する抽出後のステップを追加で実施しなくても、より高い割合の存在コールをもたらします（図を参照）。グロビンaRNAは、全血トータルRNAのaRNAピークのうち25～40%を占めています。そのため、不要なグロビン転写物を除去する方法では、トータルRNAの収率が明らかに低くなります。LeukoLOCK™による精製後に増幅されたRNAは、競合するグロビン転写物が劇的に減少するため、より高いアレイ感度を提供します。

キット収量
回収率はドナーごとに異なりますが、通常は、全血9～10 mLあたり10～20 µgのRNAになります（図を参照）。LeukoLOCK™システムを使用して回収したRNAに含まれる網状赤血球由来のαおよびβグロブリンmRNAは、典型的な未分画全血のRNAサンプル中に存在する10分の1未満の量です。