EmGFP を使用した BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 発現ベクターキットは、従来の RNAi ベクターの利点（安定した発現とウイルス送達を使用する機能）と、同一の転写産物からの組織特異的発現および複数のターゲットノックダウンの機能を組み合わせたものです。BLOCK-It™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP に含まれる pcDNA™6.2 GW/EmGFP-miR ベクターは、ターゲット配列に 100 % の相同性を持つように設計された人工 miRNA を発現するように設計されており、ターゲットの切断が生じます。このベクターには、より長い Pol II 転写産物（ pre-miRNA）からの遺伝子組み換え miRNA の切除を指示する内因性 miRNA からのフランキングおよびループ配列が含まれます。Invitrogen の受賞歴 のある BLOCK-iT™ RNAi Designer を使用すると、70 % を超えるコンストラクトが 70 % 以上のノックダウンを生成します。遺伝子組み換え miRNA の POL II 発現により、以下のことが可能になります。
o MultiSite Gateway™ の組換えを介して組織特異的またはその他の規制プロモーターを使用するオプションを備えた、CMV 即時早期プロモーターからの強力な発現。
o pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR ベクターでの Emerald GFP (EmGFP) レポーターの共シストロン発現。EmGFP 発現と miRNA のノックダウン活性との非常に強い相関関係が得られます。
o 遺伝子発現のための Invitrogen の Gateway™ デスティネーション (DEST) ベクターの多くとの互換性。分裂細胞、非分裂細胞、および初代細胞タイプの安定した形質導入のための Lentiviral ベクター、単一部位染色体統合のための Flp-In™ システム、および代替レポーター融合コンストラクトを含みます。
o 同じ転写産物での複数の操作された miRNA の発現。これにより、複数の遺伝子を同時にノックダウンし、合成表現型を生成できます。
使い方。
miR RNAi 配列を高レベルで発現させるために、pcDNA6.2-™GW/miRベクターには CMV プロモーターが含まれています（図1）。無料のオンライン BLOCK-iT™ RNAi Designer に RefSeq アクセッション番号またはヌクレオチド配列を入力するだけで、ソフトウェアは対象のターゲットに 100 % の相同性を持つ最適化された miRNA を設計します。高速ライゲーションプロトコルを使用して miRNA をベクターにクローニングし、直ちに miRNA を発現するためにトランスフェクションします。発現された miRNA は核内の内因性細胞機械（ Drosha を含む）で処理され、その後細胞質に運ばれ、Dicer によってさらに処理されます（図 2）。その後、完全に処理された miRNA が RISC に取り込まれ、そこで siRNA のように機能し、mRNA ターゲットの切断を引き起こします。
さまざまな発現オプションについては、EmGFP、miR フラ側面領域、および目的のターゲットに相同性の miRNA を含む miRNA カセットをさまざまな DEST ベクターに簡単に移動できます。これ は、miRNA カセットが pDONR™ ベクター（ BP 反応）に転写され、選択した DEST ベクター（ LR 反応）に転写される Gateway™ 組換え反応によって起こります。